【產(chǎn)品名稱】小鼠肝炎病毒探針法熒光定量 RT-PCR試劑盒
Name ：MouseHepatitisVirus(MHV)ProbegRT-PCRKit
【包裝規(guī)格】50次/盒
【預(yù)期用途】小鼠肝炎病毒(MouseHepatitisVirus ，MHV)是一種 RNA 病毒 ，病毒存在于血液和內(nèi)臟 ，特別是 肝和腎 ，也見于糞尿中 ，對幼鼠有高度的傳染性 ，小鼠肝炎是由 MHV 所致的 1 種的傳染病 ，帶毒 小鼠分布于，但在正常情況下大多呈不顯性感染 ，只在應(yīng)激因素激發(fā)下才能成為致死性疾病 ，主 要為肝炎和腦炎 ， 因此小鼠肝炎病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用 。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測小鼠肝炎病毒的試劑盒 ，它具有下列特點：
1.即開即用 ，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化 ，靈敏性高。
3.提供陽性對照 ，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高 ，引物是根據(jù)小鼠肝炎病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
【規(guī)格及成分】
成分 | 包裝 |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 500 μL |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 100μL |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL |
小鼠肝炎病毒探針法 qRT-PCR 引 物-探針混合液 | 150 μL |
小 鼠 肝 炎 病 毒 探 針 法 qRT- PCR 陽性對照(1 × 10E7 拷貝/μL) | 50 μL |
使用手冊 | 1份 |
【運輸及保存】低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品 RNA。
小鼠肝炎病毒探針法熒光定量 RT-PCR試劑盒【使用方法】一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 (以 10E2- 10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高 ， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行 ，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分 。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原 ，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照 ，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照 。
1.標(biāo)記 6 個離心管 ，分別為 6 ， 5 ， 4 ， 3 ， 2, 1。
2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液 (最好用帶芯槍頭 ， 下同) 。
3.在 6 號管中加入 5μL1 × 10E7 拷貝/μL 的陽性對照 (試劑盒提供) ，充分震蕩 1 分鐘 ，得 1 × 10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上待用。
4.換槍頭 ，在 5 號管中加入 5μL1 × 10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得) ，充分震蕩 1 分鐘， 得 1 × 10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上待用。
5.換槍頭 ，在 4 號管中加入 5μL1 × 10E5 拷貝/μL 的陽性對照 (上步稀釋所得) ，充分震蕩 1 分 鐘 ，得 1 × 10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上用 。
二、樣品 RNA 的制備
7 .如果有 N 個樣品 ，最好設(shè)置 N+2 個提取 ， 多出的一個是 PC (樣品制備陽性對照) ，一個是 NC (樣品制備陰性對照) ?？梢杂? 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣 ， 以此作為 PC 。 另外用水作為 NC。
8 .用自選方法純化樣品的 RNA ， 本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三ProbeqRT-PCR反應(yīng) (20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行)
9 .如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù) ，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管 ，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品 ， 1 個用于 PCR 陰性對照 (用水做模板) ， 6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線 。如果做定性分析 ， 并且 只做 1 次重復(fù) ，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管 ， 其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品 ， 1 個用于 PCR 陰性對照 (用水做模板) ， 1 個用于 PCR 陽性對照 (用第 4 號管中的陽性對照稀釋液做模板) 。 下面只以定量分析為描述操作步驟，
10 . 在標(biāo)記管中按下表加入各成分 (本表只列出一次重復(fù) 。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽 性對照 ， 并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)
成分/每管
| 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性對照 | PCR陽性對照管 (2-6管) |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
小鼠肝炎病毒探針法 qRT-PCR 引物-探針混合液 | 3μL | 3μL | 3μL |
待測樣品 RNA 模板 | 5μL | - | - |
超純水 | - | 5μL | - |
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液( 2-6 號) | - | - | 各 5μL ( 2 號樣到 2 號 管，3 號樣到 3 號管 … ) |
11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 30min |
預(yù)變性 | 94℃ | 10min |
qRT-PCR 反應(yīng)( 40 個循環(huán)) | 94℃ | 15 sec |
60℃ | 1min (采集 FAM 通道的熒光信號) |
四：數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測 ， 則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸 ， 以 Ct 值為縱軸 ， 繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線 。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值 ，再推算出其濃度。
13 . 如果把本試劑盒用于定性檢測 ，只判斷陽性或陰性 ，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40 。 陽 性對照必須有熒光對數(shù)增長 ，有典型擴(kuò)增曲線 ，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30 。對待測樣品 ，如果 其 Ct 大于或等于 40 則為陰性 ， 如果小于或等于 35 則為陽性 。 如果在 35-40 之間 ，則重復(fù)一次 。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性 ，如果小于 35 ，則為陽性。
