Configuration-specific Monoclonal Antibody Based 

Cdc42 Activation Assay Kit 

Catalog Number：80701 

20 assay

產(chǎn)品說(shuō)明

       小G蛋白是從屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中的一個(gè)超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個(gè)亞家族，它在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種， Cdc42參與生理活動(dòng)過(guò)程中其分子結(jié)構(gòu)會(huì)呈現(xiàn)出2種相互轉(zhuǎn)換的形式：與GTP結(jié)合的激活狀態(tài)和與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)。

       目前Cdc42蛋白活性的檢測(cè)主要是依據(jù)小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶（PAK）的p21結(jié)合區(qū)域（PBD）結(jié)合，使PAK活化從而發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而間接的進(jìn)行Cdc42活性功能的監(jiān)測(cè)。然而此方法在檢測(cè)過(guò)程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過(guò)快以及Cdc42-GTP結(jié)合蛋白與p21結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導(dǎo)致這種檢測(cè)方法的重復(fù)性較差。

        紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Cdc42活性檢測(cè)試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識(shí)別Cdc42-GTP結(jié)合蛋白，而不識(shí)別Cdc42-GDP結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡(jiǎn)單并且快速的進(jìn)行Cdc42的活性檢測(cè)。同時(shí)試劑盒中的Cdc42-GTP單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中Cdc42的活性監(jiān)測(cè)。每套試劑盒可以進(jìn)行20次檢測(cè)。

檢測(cè)原理

     武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Cdc42活性檢測(cè)試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異形態(tài)的Cdc42-GTP單克隆抗體特異性的去檢測(cè)細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行GTPγS活化處理）活性Cdc42-GTP的水平。簡(jiǎn)言之，特異性識(shí)別Cdc42活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白，然后利用protein A/G將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來(lái)，再利用特異性識(shí)別Cdc42活化構(gòu)象的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測(cè)。

試劑盒成分

1. 特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體（Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管裝--30ul (抗體濃度是1mg/ml)，抗體溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的。此抗體可以特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物中的Cdc42-GTP。

2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管裝—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。（使用時(shí)溶液需要充分混勻，再吸?。?/p>

3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶裝—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0),     750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

4. 特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克隆抗體（Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)）：小管裝--30ul (抗體濃度是1mg/ml)，抗體溶于PBS（pH 7.4）并包含有   50%的甘油。

5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管裝—100ul (10 mM) ，實(shí)驗(yàn)中0.5mL細(xì)胞裂解液使用      5ul GTPγS標(biāo)記。

6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管裝—100ul (100 mM) ，實(shí)驗(yàn)中0.5mL細(xì)胞裂解液使用5ul GDP標(biāo)記。

儲(chǔ)存條件

試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內(nèi)必須存放于4°C條件下保存。

試劑（試劑盒內(nèi)不提供，由實(shí)驗(yàn)者自行配置）

1.  刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制劑；

3.  4 °C 搖桿或者搖床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8.  免疫印跡緩沖液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

Tween-20)；

9.  免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝酸纖維素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 檢測(cè)試劑；

試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mL aprotinin（）。

樣品處理

貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養(yǎng)皿，~107個(gè)細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個(gè)直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來(lái)。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用27?的注射器針頭來(lái)回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

懸浮細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。

3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4. 向細(xì)胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個(gè)直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用27?的注射器針頭來(lái)回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽(yáng)性和陰性的對(duì)照

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有10%的Cdc42被激活，而在體外用GTPγS處理大約有90%的Cdc42被激活。

1. 準(zhǔn)備兩個(gè)離心管，每個(gè)管中各加入0.5 mL的細(xì)胞提取物（如果是純的Cdc42蛋白則每個(gè)管中加入的蛋白量為1ug）。

2. 每個(gè)管中加入20ul 0.5M EDTA(終濃度即為20 mM)。

3. 一個(gè)管中加入5ul的100X GTPγS（終濃度即為100 uM）作為陽(yáng)性對(duì)照。另一個(gè)管中加入5ul的100X GDP（終濃度即為1 mM）作為陰性對(duì)照。

4. 將離心管置于30°C條件下反應(yīng)30min并不斷攪動(dòng)。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為60mM)。

檢測(cè)步驟

Ι?；钚訡dc42 Pull-Down實(shí)驗(yàn)

1. 等分0.5-1 mL的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 緩沖液。

3. 向管中加入1ul的活性Cdc42單克隆抗體。

4. 用渦旋振蕩儀將protein A/G凝膠柱充分混勻，然后快速的吸出20ul懸浮珠漿液加入離心管中。

5. 將管置于4°C條件下孵育1H，并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

6. 5000g，離心1分鐘。

7. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

9. 次洗滌后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2X SDS-PAGE樣品緩沖液重懸樣品。

11. 樣品煮沸5min。

12. 5000g，離心10s。

II. 電泳和轉(zhuǎn)膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說(shuō)明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到PVDF或硝化纖維素膜。

III.免疫印跡反應(yīng)和檢測(cè)（所有步驟都是在室溫下進(jìn)行，并不斷攪拌）

1. 將PVDF膜浸入99%甲醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖維素膜，此步省略。

2. 封閉：用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克隆抗體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時(shí)，或者4°C條件下過(guò)夜孵育。

4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時(shí)并恒定振蕩。

6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如ECL顯色法。

示例結(jié)果

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Cdc42活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用表皮細(xì)胞因子（EGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細(xì)胞裂解物用特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26905)孵育(上圖)?；钚訡dc42珠子顆粒用特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克隆抗體(Cat # 21010)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。底部的圖展示的是細(xì)胞裂解液的活性Cdc42的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（底圖SDS-PAGE的上樣量是上圖SDS-PAGE上樣量的5%。）