潔凈車間用食品廠臭氧機(jī)滅菌后沉降菌檢測(cè)方法

      潔凈車間滅菌方法有多種：紫外線滅菌、化學(xué)熏蒸、臭氧滅菌等；這里簡單介紹臭氧滅菌后對(duì)潔凈車間沉降菌的檢測(cè)":

A:操作方法：對(duì)潔凈車間用食品廠臭氧機(jī){車間臭氧機(jī)}滅菌1小時(shí)后進(jìn)行沉降菌檢測(cè)

 B:名稱：潔凈區(qū)微生物檢測(cè)操作規(guī)程

C:關(guān)鍵詞：潔凈區(qū)、食品廠臭氧機(jī)、車間臭氧機(jī)、微生物檢測(cè)

D:目的：尋得優(yōu)質(zhì)食品廠臭氧機(jī)、車間臭氧機(jī)廠家并規(guī)范潔凈區(qū)微生物檢測(cè)

E:原理：臭氧滅菌技術(shù)

F:適用范圍：100級(jí)、1萬、10萬、30萬級(jí)潔凈區(qū)環(huán)境。

1.        沉降菌檢測(cè)

1）       在萬級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵操作點(diǎn)和潔凈室內(nèi)每周檢測(cè)一次沉降菌和浮游菌；在10萬級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)其檢測(cè)頻次為每月檢測(cè)一次。30萬級(jí)每季度檢測(cè)一次沉降菌。

2）       由微生物檢測(cè)員按《養(yǎng)基的配制操作規(guī)程的要求配制肉湯瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿使用Φ90mm×15mm，于121℃濕熱滅菌20分鐘，取出備用。

3）       做好潔凈區(qū)消毒工作，開啟潔凈區(qū)凈化空調(diào)系統(tǒng)，正常運(yùn)行不少于30分鐘；對(duì)單向流如100級(jí)的凈化工作臺(tái)和層流罩要在凈化系統(tǒng)運(yùn)行10min后開始。

4）       靜態(tài)測(cè)試在除測(cè)試人員外，室內(nèi)無生產(chǎn)人員的情況下進(jìn)行，動(dòng)態(tài)測(cè)試在已處于正常生產(chǎn)狀態(tài)下進(jìn)行。

5）       采樣點(diǎn)布置選用對(duì)角線法，要求布置地面四個(gè)方向，工作線上左右，關(guān)鍵設(shè)備頂上放置一個(gè)。

6）       萬級(jí)、10萬級(jí)、30萬級(jí)的zui少采樣點(diǎn)數(shù)可按下表確定。

在滿足zui少測(cè)點(diǎn)數(shù)的同時(shí)，還宜滿足zui少培養(yǎng)皿數(shù)，見下表

7）       百級(jí)區(qū)只有凈化工作臺(tái)下的局部范圍，其面積小于10m2，因此百級(jí)區(qū)取樣點(diǎn)至少為3個(gè)。

8）       測(cè)試人員按潔凈室級(jí)別規(guī)定的程序更換潔凈服進(jìn)入潔凈區(qū)；靜態(tài)測(cè)試時(shí)，室內(nèi)人員不得多于2人。

9）       將制備好的肉湯瓊脂培養(yǎng)基按采樣點(diǎn)布點(diǎn)位置離地0.8～1.5m處放置，打開培養(yǎng)皿蓋，暴露30分鐘，檢測(cè)人員及時(shí)填寫記錄，記錄房間溫濕度，壓差及測(cè)試狀態(tài)。

10）    蓋好皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在30～35℃中培養(yǎng)48小時(shí)，并用3只培養(yǎng)皿作對(duì)照。

11）    用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察平皿上所有菌落數(shù)，要注意菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，然后用5～10倍放大鏡檢查有否遺漏。

12）    計(jì)算平均菌落數(shù)=（M1＋M2……＋Mn）／n，式中M1：1號(hào)培養(yǎng)皿菌落數(shù)，M2：2號(hào)培養(yǎng)皿菌落數(shù)，n：培養(yǎng)皿數(shù)。

13）    用平均菌落數(shù)判斷潔凈室空氣中的微生物，潔凈區(qū)的平均菌落數(shù)（靜態(tài)測(cè)試）：100級(jí)≤1個(gè)/皿，萬級(jí)≤3個(gè)／皿，10萬級(jí)≤10個(gè)／皿，30萬級(jí)≤15個(gè)／皿。

14）    如超過標(biāo)準(zhǔn)，則必須對(duì)此區(qū)域重新消毒，重新采樣兩次，測(cè)試結(jié)果均須合格；否則要向質(zhì)量管理部通報(bào)，并采取相應(yīng)的措施。

15）    檢測(cè)人員必須向QA部門發(fā)“潔凈級(jí)別檢測(cè)記錄”，取樣和微生物培養(yǎng)及檢測(cè)人員均要在記錄上簽名，QA部門主管審核，記錄由質(zhì)量管理部保存三年。

2.        浮游菌檢測(cè)

1）       對(duì)萬級(jí)和10萬級(jí)潔凈區(qū)要進(jìn)行浮游菌的檢測(cè)，在萬級(jí)區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵操作點(diǎn)和潔凈室內(nèi)每周檢測(cè)一次，10萬級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)其檢測(cè)頻次為每月檢測(cè)一次。

2）       浮游菌取樣使用浮游菌采樣器，采樣器必須要有流量計(jì)和定時(shí)量，并按儀器的檢定周期，定期對(duì)儀器作檢定，以保證測(cè)試數(shù)據(jù)的可靠性。

3）       采樣器進(jìn)入被測(cè)房間前要先用消毒劑滅菌，用于100級(jí)潔凈室的采樣器是一直放在房間內(nèi)；采樣時(shí)使用規(guī)定為Φ150mm×15mm培養(yǎng)皿。

4）       由微生物檢測(cè)人員按《培養(yǎng)基的配制操作規(guī)程》的要求配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于121℃濕熱滅菌20分鐘，取出備用。

5）       浮游菌取樣與沉降菌一樣可分為靜態(tài)測(cè)試和動(dòng)態(tài)測(cè)試兩種狀態(tài)；各種潔凈度的采樣點(diǎn)數(shù)目和zui小采樣量如下表所示。

浮游菌取樣點(diǎn)數(shù)目及zui小采樣量

滅菌原理

臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，滅菌過程屬生物化學(xué)氧化反應(yīng)。臭氧滅菌有以下3種形式：

1.臭氧能氧化分解細(xì)菌內(nèi)部葡萄糖所需的酶，使細(xì)菌滅活死亡。

2.直接與細(xì)菌、病毒作用，破壞它們的細(xì)胞器和DNA、RNA，使細(xì)菌的新陳代謝受到破壞，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

3.透過細(xì)胞膜組織，侵入細(xì)胞內(nèi)，作用于外膜的脂蛋白和內(nèi)部的脂多糖，使細(xì)菌發(fā)生通透性畸變而溶解死亡。

臭氧殺菌

滅活機(jī)理

臭氧對(duì)細(xì)菌的滅活反應(yīng)總是進(jìn)行的很迅速。與其它殺菌劑不同的是：臭氧能與細(xì)菌細(xì)胞壁脂類雙鍵反應(yīng),穿入菌體內(nèi)部，作用于蛋白和脂多糖，改變細(xì)胞的通透性，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。臭氧還作用于細(xì)胞內(nèi)的核物質(zhì)，如核酸中的嘌呤和嘧啶破壞DNA。

滅活機(jī)理

臭氧對(duì)病毒的作用首先是病毒的衣體殼蛋白的四條多肽鏈，并使RNA受到損傷，特別是形成它的蛋白質(zhì)。噬菌體被臭氧氧化后，電鏡觀察可見其表皮被破碎成許多碎片，從中釋放出許多核糖核酸，干擾其吸附到寄存體上。

臭氧殺菌的*性是不容懷疑的。

臭氧殺菌原理

臭氧滅菌或抑菌作用，通常是物理的、化學(xué)的及生物學(xué)等方面的綜合結(jié)果。其作用機(jī)制可歸納為：（1）作用于細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，使細(xì)胞失去活動(dòng)；（2）使細(xì)胞活動(dòng)必需的酶失去活性；（3）破壞細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或使其失去功能。臭氧殺滅病毒是通過直接破壞核糖核酸或脫氧核酸完成的。而殺滅細(xì)菌、霉菌類微生物則是臭氧首先作用與細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜的構(gòu)成收到損傷，導(dǎo)致新陳代謝障礙并抑制其生長，臭氧繼續(xù)滲透破壞膜內(nèi)組織，直到死亡。

臭氧滅菌

人類自發(fā)現(xiàn)并使用臭氧以來，一直對(duì)臭氧的滅菌性能進(jìn)行試驗(yàn)[1]，這方面的試驗(yàn)報(bào)告很多，以下從幾個(gè)方面進(jìn)行綜述。

臭氧－細(xì)菌繁殖體

李懷恩等觀察了臭氧氣體對(duì)空氣中綠膿桿菌的殺滅作用。在15℃，濕度73%，臭氧濃度0.08-0.6ppm時(shí)，30分鐘內(nèi)殺滅率達(dá)到99.9%以上；伍學(xué)洲等試驗(yàn)臭氧對(duì)大腸桿菌殺滅率為*，對(duì)*殺滅率為95.9%，對(duì)綠膿桿菌殺滅率為89.8%，顧士圻等試驗(yàn)，臭氧對(duì)大腸桿菌和*殺滅率分別為99.7%、99.9%。居喜娟等試驗(yàn)用臭氧可殺滅空氣中的白色葡萄球菌99.99%；Burleson等試驗(yàn)將臭氧氣體通入染有*、大腸桿菌、熒光假單胞菌、鼠傷*、福氏痢疾桿菌、霍亂弧菌的磷酸鹽緩沖液中，作用15秒后，以上細(xì)菌全部殺滅；白希堯等發(fā)現(xiàn)臭氧水溶液殺菌作用強(qiáng)大，且速度極快，濃度為0.3mg/L的臭氧水溶液作用1分鐘，大腸桿菌和*的殺滅率均達(dá)*。

細(xì)菌芽胞

瞿發(fā)林等報(bào)告，以5.5mg/m?的臭氧作用下45分鐘，可將100mL塑料瓶內(nèi)滴染的枯草桿菌黑色變種芽胞*殺滅；居喜娟等報(bào)道，在1m?試驗(yàn)柜內(nèi)，開啟500mg/h的臭氧發(fā)生器60分鐘可對(duì)空氣中的枯草桿菌黑色變種芽胞殺滅率達(dá)99.95%；歐陽川等在動(dòng)態(tài)試驗(yàn)條件下，將臭氧氣體通入染菌井水中，臭氧濃度達(dá)3.8-4.6mg/L時(shí)，作用3-10分鐘，水中枯草桿菌黑色變種芽孢殺滅率達(dá)99.999%。

病毒

李紹忱等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10.3mg/m3濃度臭氧作用30分鐘后，乙型肝炎表面抗原（HbsAg）的滴度從1:256降至1:64。史江等報(bào)告，臭氧濃度13.6mg/m3時(shí)使用30分鐘，使HbsAg破壞99.99%，使用甲型肝炎病毒抗原（HAAg）破壞*；Wolo等實(shí)驗(yàn)證明0.5ppm的臭氧可滅活空氣中的甲型流感病毒99%；Herbold等報(bào)告，在20℃水中，臭氧濃度為0.13mg/L時(shí)，可以*的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型（PVI）。臭氧滅活病毒速度極快，當(dāng)臭氧濃度分別為0.09mg/L-0.8mg/L時(shí)，在反應(yīng)zui初5秒鐘內(nèi)，噬菌體T2即可被滅活5-7個(gè)對(duì)數(shù)值。Finch發(fā)現(xiàn)水中含臭氧濃度40μg/L時(shí)，作用20秒鐘，可使大腸桿菌噬菌體ms2滅活4個(gè)對(duì)數(shù)值。Vaughn等在4℃條件下，對(duì)比了臭氧對(duì)猿輪狀病毒SA-H和人輪狀病毒2型的滅活效果,發(fā)現(xiàn)兩種病毒均能被0.25mg/L的臭氧迅速滅活。Crpend等檢測(cè)了經(jīng)臭氧處理后的血清中愛滋病毒（HIV）的滅活情況，證明當(dāng)臭氧濃度為4mg/L時(shí)，可將滴度為106CID50/mL HIV全部滅活，病毒滴度下降6個(gè)對(duì)數(shù)值。

真菌

汪華明等報(bào)道,臭氧濃度為9.6mg/L時(shí)，作用100分鐘對(duì)雜色曲霉與桃色擬毒霉的殺滅率達(dá)*，對(duì)蠟葉枝孢霉23mg/L30分鐘、青黑霉在12.5mg/L作用35分鐘、桔青霉在15.4mg/L作用30分鐘，尖鐮孢霉在15.5mg/L時(shí)作用20分鐘，均可達(dá)*滅活率。對(duì)于煙曲霉、細(xì)交鏈孢霉、爪哇毛霉等，在臭氧濃度為3.85-10.7mg/L時(shí)作用10-20分鐘滅活率達(dá)96.4%。伍學(xué)洲等發(fā)現(xiàn)，臭氧在30分鐘內(nèi)對(duì)青霉菌的殺滅率為93.8%，對(duì)毛霉菌的殺滅率為*；白希堯等報(bào)告，濃度為15mg/L的臭氧水溶液作用1分鐘，可*地殺滅試驗(yàn)中的黑曲霉和酵母。

原蟲

Finch等比較了22℃時(shí)臭氧對(duì)蘭氏賈弟鞭毛蟲和鼠型賈弟鞭毛蟲色曩的滅活效果，當(dāng)Ct值0.86mg•min/L時(shí)，可使鼠型賈弟鞭毛蟲減少4個(gè)對(duì)數(shù)值，Ct值為2.5mg•min/L時(shí)，使蘭氏賈弟鞭毛蟲減少4個(gè)對(duì)數(shù)值。Korich等比較了臭氧、二氧化氯、氯對(duì)凈化水中的微小隱孢子蟲卵囊的滅活作用試驗(yàn)證明，1ppm的臭氧作用5分鐘可以滅活90%的卵囊，1.3ppm的二氧化氯則需作用1小時(shí)，80ppm的氯則需作用1.5小時(shí)才能達(dá)到同樣效果。

臭氧殺菌消毒

臭氧殺菌機(jī)理以氧化作用破壞微生物膜的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)殺菌作用。臭氧對(duì)細(xì)菌的滅活反應(yīng)總是進(jìn)行的很迅速，與其它殺菌劑不同的是：臭氧能與細(xì)菌細(xì)胞壁脂類雙鍵反應(yīng),穿入菌體內(nèi)部，作用于蛋白和脂多糖，改變細(xì)胞的通透性，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。臭氧還作用于細(xì)胞內(nèi)的核物質(zhì)，如核酸中的嘌呤和嘧啶破壞DNA。臭氧首先作用于細(xì)胞膜，使膜構(gòu)成成份受損傷而導(dǎo)致新陳代謝障礙，臭氧繼續(xù)滲透穿透膜而破壞膜內(nèi)脂蛋白和脂多糖，改變細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞溶解、死亡。臭氧滅活病毒則認(rèn)為氧化作用直接破壞其核糖核酸RNA或脫氧核糖核酸DNA物質(zhì)而完成的。臭氧對(duì)病毒的作用首先是病毒的衣體殼蛋白的四條多肽鏈，并使RNA受到損傷，特別是形成它的蛋白質(zhì)。噬菌體被臭氧氧化后，電鏡觀察可見其表皮被破碎成許多碎片，從中釋放出許多核糖核酸，干擾其吸附到寄存體上。