上海勁馬實驗設備有限公司作者
細胞凋亡過程中可觀察到系列形態(tài)學特征和生化特征。早期凋亡信號的效應產(chǎn)生于胞內(nèi),此時細胞膜保持完整?,F(xiàn)已發(fā)展出幾種方法以檢測凋亡細胞胞內(nèi)的多種效應,包括:DNA 片段的檢測、膜對稱性的變化、caspases 激活、以及細胞死亡相關蛋白水平的變化等。多數(shù)檢測使用的底物和Marker 適用于絕大多數(shù)種類的哺乳動物。
凋亡細胞染色體DNA 以核小體為單位的切割導致細胞不可逆死亡??梢圆捎肗ucleosome ELISA,對產(chǎn)生的單體及寡聚核DNA 片段進行定量。核小體的DNA 成分被捕獲于酶標板上,使用生物素標記的抗組蛋白抗體檢測捕獲的核小體數(shù)量。組蛋白-DNA 片段的量反應了一個特定樣品中死亡及瀕臨死亡的細胞的量。
DNA 片段也可通過片段末端標記進行原位檢測,DNA 片段末端標記可通過熒光染料或比色底物方法進行檢測。另外,細胞形態(tài)的變化如胞膜皺摺或出泡、核染色質(zhì)致密、胞質(zhì)濃縮等,都可作為細胞凋亡的證據(jù)。采用熒光染料進行末端標記的可用流式細胞技術進行定量,其光散射變化也可支持由單一參數(shù)得出的結論。DNA 片段可以從凋亡細胞中分離(Suicide TrackTM DNA ladder Isolation Kit, )并使用瓊脂糖電泳進行分析。約180bp 的多倍寡核小體片段在電泳上呈典型的梯狀條帶,可進一步證實凋亡的存在。若使用Pellet Paint Co-Precipitant,只需室溫操作,兩分鐘即幫助DNA 沉淀更快捷方便。
線粒體膜電位和膜通透性的變化也是凋亡細胞一個重要特點??墒褂肅ytochrome c ELISA Kit或Cytochrome c Release Apoptosis Assay Kit試劑盒檢測凋亡細胞線粒體所釋放的細胞色素C。也可使
用Cytosol/Mitochondria Fractionation Kit分離凋亡細胞線粒體,其膜電位可通過MitoCaptureTM Apoptosis Detection Kit檢測。凋亡細胞另一個生化特征是細胞膜內(nèi)側的磷脂酰絲氨酸從胞質(zhì)轉至胞外。膜聯(lián)蛋白中的Annexin Ⅴ,是一種磷脂結合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有強親和力。通過使用Annexin Ⅴ-FITC或 Annexin Ⅴ-Biotin ,Apoptosis Detection Kit ,及RAPIDTM 方法進行凋亡細胞早期檢測。可使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測。同時使用PI,根據(jù)細胞膜的通透性區(qū)分早期凋亡細胞和壞死細胞。
凋亡過程中細胞核同樣發(fā)生了結構變化。接收到凋亡信號后,核基質(zhì)蛋白(NMPs)釋放。NMP 的釋放與細胞死亡相,MERCK 的Cell Death Detection(NMP) ELISA可定量檢測細胞培養(yǎng)上清中的NMP 水平變化。此種檢測方法優(yōu)于其它方法的原因在于可以直接檢測組織培養(yǎng)基中NMPs 的水平,而不需細胞總裂解物,從而避免了細胞計數(shù)和樣品準備等操作。除了結構變化,凋亡細胞谷胱甘肽水平會降低,可通過Glutathione Apoptosis Assay Kit進行檢測。
凋亡可被系列環(huán)境危害、發(fā)育信號等誘導產(chǎn)生,免疫耐受的誘導和保持,涉及細胞表面受體的參與。Fas(APO-1, CD95) 是主要的死亡受體,在多種細胞中引發(fā)凋亡過程。Fas 配體(FasL/CD95L)與Fas 結合,激活的Fas 進而激活包含caspase 在內(nèi)的幾種效應蛋白。FAS/APO-1 ELISA Kit可以檢測細胞抽提物、組織培養(yǎng)物、血清中Fas 的水平。同樣,F(xiàn)as Ligand ELISA 可定量檢測上述各種形式樣品中的膜結合FasL 和可溶性FasL。兩種檢測試劑盒都具有很好的靈敏度和度。另外兩種ELISA 試劑盒都提供96 孔板形式,適于高通量篩選。
Caspases 參與Fas 介導的細胞凋亡的情況現(xiàn)已闡明。Caspase-8 和caspase-9 啟動效應因子caspase-3 ,后者切割細胞內(nèi)含有特定識別序列的底物。針對caspases 的活性檢測,通過對特定底物的切割、釋放出熒光產(chǎn)物。同時提供陽性對照、陰性對照、特異的caspase 抑制劑以輔助解釋實驗結果。另外caspase-3 、caspase-8 和caspase-9 活性檢測試劑盒都提供高通量形式幫助篩選鑒定觸發(fā)細胞凋亡信號的因子。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)幾種抑制凋亡的蛋白。Bcl-2 家族是此領域現(xiàn)在了解zui多的一系列蛋白。Bcl-2 的切割和失活可用Bcl-2 ELISA監(jiān)測。已發(fā)現(xiàn)凋亡過程中Bcl-2 水平降低,DNA 降解片段、Annexin Ⅴ的結合、NMP 水平增加等。為*了解細胞凋亡,一個具體實驗可能需要聯(lián)合應用以上述及的幾種檢測手段以確定凋亡進程。
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