建立一個(gè)能產(chǎn)生高水平的反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的細(xì)胞系是一個(gè)*的過(guò)程。首先，必須將反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體穩(wěn)定地導(dǎo)入一種適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系中。當(dāng)產(chǎn)生了穩(wěn)定的細(xì)胞系后，必須對(duì)之進(jìn)行鑒定，從中選出能產(chǎn)生具有正確結(jié)構(gòu)的高滴度的病毒的細(xì)胞系。
實(shí)驗(yàn)材料    包裝細(xì)胞系
試劑、試劑盒    HEPESCaCl2甘油DMSO
儀器、耗材    培養(yǎng)皿培養(yǎng)板離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  在轉(zhuǎn)染前1天，在10 cm 培養(yǎng)皿中接種包裝細(xì)胞，接種密度大約相當(dāng)于10%~20%片的細(xì)胞數(shù)。

2.  將10 μg 含有藥物抗性基因的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA加入0.5 ml HeBS。再加入32 μl 2 mol/l CaCl2并同時(shí)輕輕搖晃。用手指輕彈試管外壁約 30 s，然后在室溫下溫育45 min，直到形成細(xì)小的淡藍(lán)色沉淀。

3.  移去包裝細(xì)胞的培養(yǎng)液，吸取HeBS-DNA沉淀輕輕加在培養(yǎng)皿的*。在組織培養(yǎng)操作櫥內(nèi)讓細(xì)胞接觸DNA 20 min，大約10 min 后，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿以均勻分散DNA溶液，加10 ml 培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于37℃溫育4 h。

4.  吸盡培養(yǎng)液，輕輕加入2.5 ml 室溫的HeBS/甘油溶液。將培養(yǎng)血放回培養(yǎng)箱中溫育3.5 min 或90 s，或?qū)τ谔囟?xì)胞經(jīng)測(cè)定的合適的溫育時(shí)間。快速棄除HeBs/甘油溶液，細(xì)胞用10 ml 培養(yǎng)液輕輕清冼， 重復(fù)用培養(yǎng)液清洗1次，加5 ml 含有血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)18~24 h。

5.  移出培養(yǎng)液，用0.45 μm的濾器過(guò)濾，獲得的上清含有短暫產(chǎn)生的病毒；將其貯存于 -70℃或-80℃，或者立即用于感染另一個(gè)帶有不同類別的包膜基因的包裝細(xì)胞系， 以產(chǎn)生一個(gè)被感染的產(chǎn)生病毒的細(xì)胞系。
 
6.  在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中加10 ml 培養(yǎng)液，培養(yǎng)2~3天，然后繼續(xù)步驟10。
 
7.  在感染前1天，將包裝細(xì)胞系按1：10至1：20傳代。
 
8.  移去將要感染的包裝細(xì)胞系的培養(yǎng)液。加病毒如下：用于感染一個(gè)10 cm 的培養(yǎng)皿上的細(xì)胞，稀釋0.1~1.0 ml 毒原液至終體積3~5 ml 并加800 μg/ml 的polybrene至8 μg/ml；如感染一個(gè)6 cm 的培養(yǎng)皿，稀釋0.1~1 ml 病毒原液至終體積2 ml，并加800μg/ml  的polybrene至終濃度8 μg/ml 溫育1 h。
 
9.  對(duì)于10 cm 培養(yǎng)皿則，加培養(yǎng)至終體積10 ml，對(duì)于6 cm 培養(yǎng)皿則加4 ml。培養(yǎng)2~3天。
 
10.  在轉(zhuǎn)染或感染后2~3夭，將轉(zhuǎn)染的或惑染的細(xì)胞按1：10或1：20傳代， 加選擇培養(yǎng)液，培養(yǎng)3天。換新的選擇培養(yǎng)液，再培養(yǎng)4~7天直至可見到細(xì)胞克隆。

11.  用克隆圓柱體挑取分隔良好的細(xì)胞克隆，每個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至2個(gè)24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中。生長(zhǎng)至50%~90%匯片。

12.  移去培養(yǎng)液，換成1/2體積的培養(yǎng)液。視包裝細(xì)胞系不同而培養(yǎng)1~3天，移出培養(yǎng)液，立即對(duì)其進(jìn)行直接滴定，或貯存于-70℃或-80℃。

13.  繼續(xù)傳代各產(chǎn)病毒細(xì)胞克隆，直至其可凍存，和（或）直至鑒別出的產(chǎn)病毒細(xì)胞。當(dāng)鑒定出一個(gè)好的產(chǎn)病毒細(xì)胞克隆時(shí)，細(xì)胞分裝在20~25支凍存管（1~2 ml 每支） 中，培養(yǎng)液含10%~50%DMSO，在液氮中凍存。
收起 
注意事項(xiàng)    
1.  如果轉(zhuǎn)染的目的是為了生成穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細(xì)胞系，有兩種選擇。*種選擇是從那些已經(jīng)穩(wěn)定整合了載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中進(jìn)行選擇。這些細(xì)胞可置于藥物選擇之下，對(duì)產(chǎn)生的藥物抗性細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)毒篩選。第二種選擇是用“交叉感染"的包裝細(xì)胞系。上述第5步中收集到的短暫產(chǎn)生的病毒可用來(lái)感染另一個(gè)包裝細(xì)胞系，如步驟7~9。其后被感染的包裝細(xì)胞可置于藥物選擇之下。無(wú)論用哪種方法，目的都是為了分離穩(wěn)定整合了病毒基因組并產(chǎn)生可能的zui高滴度的包裝細(xì)胞。

2.  這個(gè)方法較用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞方法可能更受次迎，因?yàn)橛筛腥径a(chǎn)生的前病毒常常是與宿主基因組穩(wěn)定地并在整合后不發(fā)生重排或丟失。用這種方法時(shí)必須用表達(dá)不同類別的病毒糖蛋白的兩種包裝細(xì)胞系，當(dāng)一個(gè)包裝細(xì)胞系產(chǎn)生一種持定的env搪蛋白時(shí)，該包裝細(xì)胞的表面的受體就被那種病毒糖蛋白結(jié)合而被阻斷。當(dāng)用交叉感染時(shí)，兩種包裝細(xì)胞系必須是同源的。

測(cè)定病毒滴度
實(shí)驗(yàn)材料    病毒原液
試劑、試劑盒    G418
儀器、耗材    離心機(jī)培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  感染的前1天按1：10至1：20將靶細(xì)胞NIH 3T3分傳于6 cm 培養(yǎng)皿中。
 
2.  進(jìn)行感染的當(dāng)天，移去靶細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入含有病毒原液的培養(yǎng)液。用1~2 ml 含 有0.01 μl~0.1 ml 病毒原液的培養(yǎng)液感染6  cm 培養(yǎng)中的細(xì)胞，或3~5 ml 感染10 cm 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞。對(duì)于鼠源性的或禽源性的E亞群，加800μg/ml 的polybrene至終濃度8μg/ml，在37℃溫育細(xì)胞1~3 h。
 
3.  用培養(yǎng)液稀釋polybrene至2 μg/ml，并培養(yǎng)至少2或3個(gè)細(xì)胞周期。
 
4.  如果病毒攜帶了一個(gè)組織化學(xué)標(biāo)記基因如lacZ則感染的細(xì)胞可用Xgal染色，不需要進(jìn)行藥物選擇。計(jì)數(shù)藍(lán)染的細(xì)胞，接著按步驟7計(jì)算滴度。

5.  如果病毒攜芾了藥物抗性基因，將感染的細(xì)胞分傳入選擇培養(yǎng)液中。如果抗性基因是neo將細(xì)胞按1：10至1：20傳代，分傳入2個(gè)各含有G418的10 cm 的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天。
 
6.  換液，內(nèi)含適當(dāng)?shù)倪x擇藥物。共培養(yǎng)7~10天，屆時(shí)應(yīng)可見到細(xì)胞克隆。在克隆擴(kuò)散之前計(jì)數(shù)其數(shù)目

7.  按如下公式計(jì)算滴度（RCFU表示抗性CFU）

或，如果病毒攜帶lacZ基因，

 

粗略的估計(jì)是，病毒滴度的變化大于3倍即為有顯著差異。

8.  用一種分析方法證明產(chǎn)病毒克隆所產(chǎn)生的病毒沒有發(fā)生重排或丟失。