一、引物搜索 

1.  打開Primer premier5.0軟件，調(diào)入人瘦素（leptin）基因序列：點擊“file"    “open"   “ DNA sequence"；或者直接點擊 “file"  “new"  “DNA sequence"，彈出一對話框如下圖，然后將序列人瘦素(leptin) 基因復(fù)制在空白框。

 

 

2.  序列文件顯示如圖，點擊“Primer"；

 

3.  進一步點擊“search" 按鈕，出現(xiàn)“search criteria"窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目的（Seach For）有三種選項，PCR引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區(qū)域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數(shù)選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項參數(shù)。我們將Product Size設(shè)置300－350，其他參數(shù)使用默認值。

 

然后點擊“OK" ，隨之出現(xiàn)的Search Progress窗口中顯示Search  Completed時，再點擊“OK"。

 

4、這時搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，并按優(yōu)劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標基本都能達標。

 

5.  按照搜尋結(jié)果顯示，在主窗口中檢查該引物對的二級結(jié)構(gòu)情況，逐條分析，依次篩選。下面進行序列篩選：點擊其中一對引物，如第21#引物，在“Peimer Premier"主窗口，如圖所示：該圖分三部分，zui上面是圖示PCR模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，zui下面是四種重要指標的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引發(fā)情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時，按鈕由“None" 變成“Found" ，點擊該按鈕，在左下角的窗口中就會出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此的情況是zui下面的分析欄沒有“Found"，只有“None" 。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的*退火溫度，可參考應(yīng)用。

 

二、引物分析 

1.  打開oligo的頁面如下：

 
2.  單擊file菜單再點open或點擊“打開"快捷圖標或者用快捷鍵“CTrl＋O"可彈出一對話框，然后選擇序列人瘦素(leptin) 基因。出現(xiàn)以下窗口。

 

3.  點擊“window"再點擊“Tile"，出現(xiàn)以下窗口，圖中顯示的三個指標分別為Tm、ΔG和Frq，因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標。

?G值反映了序列與模板的結(jié)合強度，引物的?G值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低。

Tm值曲線以選取72℃附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。

Frq曲線為“Oligo 6"新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復(fù)機率大小。選取引物時，宜選用3’端Frq值相對較低的片段。

 

4.  在設(shè)計時，可依據(jù)圖上三種指標的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成紅色，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。

 

5.  當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對引物進行評價。可以用“Analyse"菜單分析你的引物：比如有無引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等等。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來說，這兩項結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好。當(dāng)然，在設(shè)計克隆目的的PCR引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會太低。這種PCR需要通過靈活調(diào)控退火溫度以達到效果，對引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測就不應(yīng)要求太高。第三項檢查為GC含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，這時應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。

當(dāng)我們結(jié)束以上三項檢測，按Alt+P鍵彈出PCR窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm值等參數(shù)，zui有用的是還給出了*的*退火溫度和簡單的評價。

1.  注意：在填antisense時要注意3’到5’翻轉(zhuǎn)成5’到3’