檸檬酸合酶CS測(cè)試盒_乙醛酸循環(huán)系列_分光法
測(cè)定方法：分光光度法
產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做估量定
測(cè)定意義：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在於動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸迴圈個(gè)限速酶，是三羧酸迴圈主要調(diào)控位點(diǎn)之一。
測(cè)定原理：
CS催化乙醯CoA和草醯乙酸產(chǎn)生檸檬醯，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特徵吸光值。
檸檬酸合酶CS測(cè)試盒_乙醛酸循環(huán)系列_分光法
自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體50mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：液體10mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：液體1mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體55mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入2.4mL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
①稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
②將勻漿600g，4℃離心5min。
③棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④上清液即胞漿提取物，可用於測(cè)定從線粒體洩漏的CS（此步可選做）。
⑤在步驟④的沉澱中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重複30次），用於線粒體CS測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）在試劑五中加入1.2mL無水乙醇和26mL試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）孵育5min；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）測(cè)定管：在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑五和40μL試劑六，混勻，37℃反應(yīng)15min後立即測(cè)定吸光值A(chǔ)1。
（3）對(duì)照管：在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑四和40μL試劑六，混勻，37℃反應(yīng)15min後立即測(cè)定吸光值A(chǔ)2。
（4）計(jì)算ΔA=A1-A2，每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
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