ImmunoClone

ImmunoClone使用His-tag有下面優(yōu)點：

1.標簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標蛋白的功能；

2.His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性；

3.His標簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究；

4.His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備抗體；

5.可應(yīng)用于多種表達系統(tǒng)，純化的條件溫和；

6.可以和其它的親和標簽一起構(gòu)建雙親和標簽。

蛋白標簽都需要去除嗎？

一般為了不影響目的蛋白的后續(xù)應(yīng)用，都會選擇一定的方式將表達時帶上的各種標簽去除。所以在設(shè)計構(gòu)建載體時可以在標簽蛋白和外源蛋白之間加上蛋白酶識別位點，這樣表達純化得到融合有標簽的目的蛋白后通過蛋白酶切的方式將標簽去除，得到完整的目的蛋白。這些常用的蛋白酶位點有：HRV 3C蛋白酶切位點、TEV蛋白酶切位點、腸激酶切位點、SUMO蛋白酶切位點等。但是也有幾點需要說明：

1）這些酶切位點特異性都比較高，但切割效率各不相同；

2）除了SUMO蛋白酶之外，其它常用蛋白酶切除標簽后都會殘留幾個氨基酸殘基。SUMO蛋白酶識別的是SUMO標簽的空間結(jié)構(gòu)，然后將這個標簽完整切除，不會留下多余的氨基酸殘基；

3）蛋白酶的切割效率也受識別位點附近的氨基酸殘基性質(zhì)的影響，具體可以參見有關(guān)文獻；

4）有些標簽比較小，免疫原性也很弱，一般不用切除，也不會對后續(xù)研究和應(yīng)用產(chǎn)生影響，可以不必切除。但是有些大的標簽，如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO標簽等等，還是需要切除的。

蛋白標簽是加在N端還是C端呢？

N-端或C-端標記的選擇還需要根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、定位等特性。例如對于蛋白太小容易被降解的和比較難表達的蛋白，可以利用5’端的蛋白標簽。這樣既能保證蛋白的穩(wěn)定性，也對外源蛋白的免疫原性影響也很小，該法適用于表位篩選。如果目的蛋白是分泌蛋白，就會遇到在目的蛋白分泌到高爾基體的過程中，蛋白5’端的信號肽，會被酶切掉的問題。這樣，你標簽要是裝在5’端，就沒什么用了。

C端His標簽后未馬上終止對His標簽特性會不會有影響？

His分離純化的原理為組氨*殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對重組蛋白進行分離純化，若C端His標簽后未添加終止密碼子，多余的氨基酸可能會影響His標簽的空間構(gòu)象從而影響其掛壁效果。