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東北師范大學PLOS發(fā)表CRISPR研究新突破
點擊次數：675 發(fā)布時間：2015-4-3
來自東北師范大學的研究人員報告稱，他們利用CRISPR/Cas9技術在小鼠中實現了基因組大片段的刪除和插入。這一研究成果發(fā)布在3月24日的《PLOS ONE》雜志上。
東北師范大學的鄭耀武（Yaowu Zheng）教授和馮學超(Xuechao Feng)副教授是這篇論文的共同通訊作者。鄭耀武教授長期從事基因表達和調節(jié)研究，曾建立了多種轉基因動物和基因定位修飾動物模型,在Nature（5篇）, Science （2篇）、PNAS等雜志上發(fā)表多篇重要論文。馮學超副教授的主要研究方向是細胞水通道基因功能及動物轉基因技術。
遺傳工程小鼠是一種可用于分析基因功能的強大工具。傳統的方法是通過同源重組來生成攜帶靶突變的小鼠。這種技術利用了培育的胚胎干細胞來獲得嵌合體小鼠。過程繁瑣、成本高昂且費時。近年來，鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活樣效應因子核酸酶(TALENs)和CRISPR/Cas9系統被開發(fā)出來用于基因組編輯。
而CRISPR/Cas9系統是三者之中且zui容易應用的工具。這一系統是通過細菌的II型規(guī)律成簇的間隔短回文重復(CRISPR)序列和它自身一種非常的Cas9核酸酶，來靶向目的基因造成特異的雙鏈斷裂(DSBs)而實現基因組編輯的。其已成功地應用于改造包括斑馬魚、小鼠、猴、大鼠等各種生物和人類細胞（延伸閱讀：北京大學劉東課題組：用CRISPR技術調控基因表達）。
DNA大片段的插入、刪除或替換是基因組編輯中面臨的一個主要問題，通常片段越大重組的效率就越低。事實上，許多研究報道改造的片段大小都是1kb左右。而在許多情況下，例如刪除基因簇、除去長鏈非編碼RNAs(lncRNA)以及置換調控序列等都需要改變大片段的基因組序列。盡管一些不同的技術被開發(fā)出來用以解決這問題。例如，利用BAC和YAC系統來靶向相對較大的DNA片段。但其效率卻遠不能令人滿意。
在這篇新文章中，東北師范大學的研究人員利用CRISPR/Cas9系統在小鼠實現了DNA大片段的刪除和插入，包括刪除大小約為65kb的整個Dip2a基因，以及插入超過5kb的β-半乳糖苷酶(lacZ)報告基因。通過PCR和測序研究人員證實大約11.8% (11/93)的胚胎干細胞克隆65kb刪除結果為陽性。通過G418選擇ES細胞，他們獲得了高靶向效率，左右臂效率分別為46.2% (12/26)和73.1% (19/26)。存活幼崽和注射胚胎定向大片段刪除效率分別為21.4%和6.0%。通過ES細胞轉染和直接注射受精卵將lacZ報告基因定向插入NEO cassette的效率分別為27.1% (13/48)和11.1% (2/18)。
作者們表示，這些程序是通過直接共同注射受精卵或用細胞質粒DNA共同轉染胚胎干細胞，繞過了體外轉錄。采用這些方法來生成小鼠模型從技術上講非常容易、節(jié)約時間且符合成本效益，將必定會推動基因功能研究。