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閱讀：281發(fā)布時間：2017-5-9
生物大分子樣品的保存
生物大分子制成品的正確保存極為重要，一旦保存不當(dāng)，辛辛苦苦制成的樣品失活、變性、變質(zhì)，使前面的全部制備工作化為烏有，損失慘重，全功盡棄。
影響生物大分子樣品保存的主要因素有：
⑴空氣：空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動氧化?？諝庵形⑸锏奈廴究墒箻悠纷冑|(zhì)，樣品吸濕后會引起潮解變性，同時也為微生物污染提供了有利的條件。某些樣品與空氣中的氧接觸會自發(fā)引起游離基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，還原性強(qiáng)的樣品易氧化變質(zhì)和失活，如維生素C、巰基酶等。
⑵溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，溫度升高10℃，氧化反應(yīng)約加快數(shù)倍，酶促反應(yīng)增加1～3倍。因此通常絕大多數(shù)樣品都是低溫保存，以抑制氧化、水解等化學(xué)反應(yīng)和微生物的生成。
⑶水份：包括樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。
⑷光線：某些生物大分子可以吸收一定波長的光，使分子活化不利于樣品保存，尤其日光中的紫外線能量大，對生物大分子制品影響zui大，樣品受光催化的反應(yīng)有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因此樣品通常都要避光保存。
⑸樣品的pH：保存液態(tài)樣品時注意其穩(wěn)定的pH范圍，通?？蓮奈墨I(xiàn)和手冊中查得或做實(shí)驗(yàn)求得，因此正確選擇保存液態(tài)樣品的緩沖劑的種類和濃度就十分重要。
⑹時間：生化和分子生物學(xué)樣品不可能*存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。
現(xiàn)以保存蛋白質(zhì)和酶為例：
⑴低溫下保存：由于多數(shù)蛋白質(zhì)和酶對熱敏感，通常35℃～40℃以上就會失活，冷藏于冰箱一般只能保存一周左右，而且蛋白質(zhì)和酶越純越不穩(wěn)定，溶液狀態(tài)比固態(tài)更不穩(wěn)定。因此通常要保存于－5℃～－20℃，如能在－70℃下保存則zui為理想。極少數(shù)酶可以耐熱：如核糖核酸酶可以短時煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90℃；蔗糖酶在50℃～60℃可以保持15 min～30 min不失活。還有少數(shù)酶對低溫敏感，如鳥肝丙酮酸羧化酶25℃穩(wěn)定，低溫下失活，過氧化氫酶要在0℃～4℃保存，冰凍則失活，羧肽酶反復(fù)凍融會失活等。
⑵制成干粉或結(jié)晶保存：蛋白質(zhì)和酶固態(tài)比在溶液中要穩(wěn)定的多。固態(tài)干粉制劑放在干燥劑中可長期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，－15℃下可保存8年。通常，酶與蛋白質(zhì)含水量大于10％，室溫低溫下均易失活，含水量小于5％時，37℃活性會下降，如要抑制微生物活性，含水量要小于10％，抑制化學(xué)活性，含水量要小于3％。此外要特別注意酶在凍干時往往會部分失活。
⑶在保護(hù)劑下保存：很早就有人觀察到，在無菌條件下，室溫保存了45年的血液，血紅蛋白僅有少量改變，許多酶仍保留部分活性，這是因?yàn)檠褐杏械鞍踪|(zhì)穩(wěn)定的因素，為了長期保存蛋白質(zhì)和酶，常常要加入某些穩(wěn)定劑：例如：①惰性的生化或有機(jī)物質(zhì)：如糖類、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持穩(wěn)定的疏水環(huán)境。②中性鹽：有一些蛋白質(zhì)要求在高離子強(qiáng)度（1 mol/L～4mol/L或飽和的鹽溶液）的極性環(huán)境中才能保持活性。zui常用的是：MgSO4、NaCl、(NH4)SO4等。使用時要脫鹽。③巰基試劑：一些蛋白質(zhì)和酶的表面或內(nèi)部含有半胱氨酸巰基，易被空氣中的氧緩饅氧化為磺酸或二硫化物而變性，保存時可加入半胱氨酸或巰基乙醇。
總之，對樣品的保存必須給以只夠的重視，一些常用酶的保存條件可參見《生物化學(xué)制備技術(shù)》（蘇拔賢主編）一書中的"一些酶保存的條件和穩(wěn)定性"表，其他各種生物大分子和生物制劑的保存條件，可查閱有關(guān)的文獻(xiàn)和酶學(xué)手冊。
6. 分離純化方法的選擇
生物大分子能否率地制備成功，關(guān)鍵在于分離純化方案的正確選擇和各個分離純化方法實(shí)驗(yàn)條件的探索。選擇與探索的依據(jù)就是生物大分子與雜質(zhì)之間的生物學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)上的差異。由本章前述的生物大分子制備的各種特點(diǎn)可以看出，分離純化方案必然是千變?nèi)f化的。
制備生物大分子的方法可以粗略地分類如下：① 以分子大小和形態(tài)的差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。② 以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。③ 以電荷差異為依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、吸附層析和離子交換層析等。④ 以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析等。
表2-2 各種主要分離純化方法的比較：
方 法
原 理
優(yōu) 點(diǎn)
缺 點(diǎn)
應(yīng)用范圍
沉淀法
蛋白質(zhì)的沉淀作用
操作簡便、成本低廉、對蛋白質(zhì)和酶有保護(hù)作用，重復(fù)性好
分辨力差，純化倍數(shù)低，蛋白質(zhì)沉淀中混雜大量鹽分
蛋白質(zhì)和酶的分級沉淀
有機(jī)溶劑沉淀
脫水作用和降低介電常數(shù)
操作簡便，分辨力較強(qiáng)
對蛋白質(zhì)或酶有變性作用，成本較高
各種生物大分子的分級沉淀
選擇性沉淀
等電點(diǎn)、熱變性、酸堿變性等沉淀作用
選擇性較強(qiáng)，方法簡便，種類較多
應(yīng)用范圍較窄
各種生物大分子的沉淀
結(jié)晶法
溶解度達(dá)到飽和，溶質(zhì)形成規(guī)則晶體
純化效果較好，可除去微量雜質(zhì)，方法簡單
樣品的純度、濃度都要很高，時間長
蛋白質(zhì)或酶等
吸附層析
化學(xué)、物理吸附
操作簡便
易受離子干擾
各種生物大分子的分離、脫色、和去熱源
離子交換層析
離子基團(tuán)的交換
分辨力高，處理量較大
需酸堿處理樹脂平衡洗脫時間長
能帶電荷的生物大分子
凝膠過濾層析
分子篩的排阻效應(yīng)
分辨力高，不會引起變性
各種凝膠介質(zhì)昂貴，處理量有限制
分子量有明顯差別的可溶性生物大分子
分配層析
溶質(zhì)在固定相和流動相中分配系數(shù)的差異
分辨力高，重復(fù)性較好，能分離微量物質(zhì)
影響因子多，上樣量太小
用于各種生物大分子的分析鑒定
親和層析
生物大分子與配體之間有特殊親和力
分辨力很高
一種配體只能用于一種生物大分子，局限性大
各種生物大分子
聚焦層析
等電點(diǎn)和離子交換作用
分辨力高
進(jìn)口試制昂貴
蛋白質(zhì)和酶
固相酶法
待分離物與固相載體之間有特異親和力
分辨力高，用于連續(xù)生產(chǎn)
有局限性
抗體、抗原、酶和底物
等電聚焦連續(xù)電泳
等電點(diǎn)的差異
分辨力很高 ，可連續(xù)制備
儀器試劑昂貴
蛋白質(zhì)和酶
高速與超速離心
沉降系數(shù)或密度的差異
操作方便，容量大
離心機(jī)設(shè)備昂貴
各種生物大分子
超濾
分子量大小的差異
操作方便，可連續(xù)生產(chǎn)
分辨力低，只能部分純化
各種生物大分子
制備HPLC
凝膠過濾、離子交換、反向色譜等
分辨力很高，直接制備出純品
制備柱和HPLC儀器昂貴
各種生物大分子
在分離純化流程中，早期和晚期的分離純化方法的選擇有明顯的不同：
⑴ 早期分離純化
1) 特點(diǎn)：①粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜。②欲制備的生物大分子濃度很稀。③物理化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)很多。④希望能除去大部分與目的產(chǎn)物物理化學(xué)性質(zhì)差異大的雜質(zhì)。
2) 對所選方法的要求：①要快速、粗放。②能較大地縮小體積。③分辨力不必太高。④負(fù)荷能力要大。
3) 可選用的方法：吸附；萃??；沉淀法（熱變性、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等）；離子交換（批量吸附、胖柱交換）；親和層析等。
⑵晚期分離純化
1) 可選用的方法：吸附層析、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備HPLC等。
2)要注意的一些問題：
①鹽析后要及時脫鹽。
②用凝膠過濾時如何縮小上樣體積，因?yàn)槟z層析柱的上樣體積只能是柱床體積的1/10～1/6，也可以使用串聯(lián)柱以加大柱床體積。
③必要時也可以重復(fù)使用同一種分離純化方法，例如分級有機(jī)溶劑沉淀，分級鹽析，連續(xù)兩次凝膠過濾或離子交換層析等。
④分離純化步驟前后要有科學(xué)的安排和銜接，盡可能減少工序，提率。例如吸附不可以放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子交換要放在凝膠過濾之前，因?yàn)殡x子交換層析的上樣量可以不受限制，只要不超過柱交換容量即可。
⑤分離純化后期，目的產(chǎn)物的純度和濃度都大大提高，此時對于很多敏感的酶極易變性失活，因此操作步驟要連續(xù)、緊湊，盡可能在低溫下（如在冷室中）進(jìn)行。
⑥得到zui終產(chǎn)品后，必要時要立即冰凍干燥，分裝并寫明標(biāo)簽，－20℃ 或
－70℃保存。
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