DNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型)使用說明書
(貨號:WLN8203KIT)
原理概述:
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù):在常溫恒溫下,重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA,在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下,侵入雙鏈DNA模板;在侵入位點形成D-loop區(qū)域,并開始對DNA雙鏈進行掃描;待找到與引物互補的目的區(qū)域后,復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時,聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端,開始鏈的延伸。依賴nfo酶的作用,加入根據(jù)模版設(shè)計的特異的分子探針,使用膠體金技術(shù)(三明治夾心法)可以對zui終結(jié)果進行檢測。
產(chǎn)品特點:
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)時間短(僅需12 mins)等優(yōu)點,反應(yīng)組分為干粉狀態(tài),操作簡便,易于保存。
本試劑對設(shè)備要求低,金屬浴、水浴鍋等即可進行反應(yīng)操作,無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設(shè)備。
引物設(shè)計:
建議使用長度在 30-35 bp的引物,引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度;下游引物的5’端標記一個修飾基團(常用shengwusu)。引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴增;擴增子長度建議在150-300 bp,通常不超過500 bp。
熒光探針設(shè)計:
在上下游引物中間,設(shè)計一段長度為46-52nt與目的片段互補的序列;5’端修飾一個抗原標記(典型FAM); 在5’端和3’末端的中部位置標記一個dSpacer(si氫呋喃,THF),作為nfo的識別位點;3’末端標記一個修飾基團,例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。
試劑盒組成:
組成 | 含量 |
A buffer | 1.6 mL×1管 |
B buffer | 150 μL×1管 |
試劑 | 48份 |
使用說明書 | 1份 |
試劑盒儲存:
運輸條件:低溫運輸;
儲存條件:儲存溫度 ≤ -20 oC,避光保存,避免重壓、反復(fù)凍融;
產(chǎn)品有效期:12個月。
操作步驟:提前30分鐘將試劑盒所需組分取出,室溫融化,震蕩混勻。
1) 每個干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer(注意:A buffer需*融化混勻,否則會對實驗效果產(chǎn)生影響);
2) 每個反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針(引物和探針濃度為10 μM,對于多個反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中);
3) 向反應(yīng)管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板(可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積,并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積,至模板與ddH2O總體積為13.5 μL);
4) zui后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合(對于多個反應(yīng),建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè),上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻);
5) 混勻后,將反應(yīng)液甩(或快速離心)至管子底部,然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37-39 oC孵育8-12 mins;
6) 反應(yīng)結(jié)束后,取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中,混合均勻后,將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡,5 mins內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測線判讀結(jié)果。
體系配制
組分 | 體積(μL) |
A buffer | 29.4 |
上游引物(10 μM) | 2 |
下游引物(10 μM) | 2 |
探針(10 μM) | 0.6 |
ddH2O和核酸模板 | 13.5 |
B buffer | 2.5 |
總體積 | 50 |
注意事項:
1. 由于試劑盒靈敏度非常高,在進行反應(yīng)時請注意避免微量核酸污染,并盡量考慮設(shè)置空白對照以確認是否有核酸污染。
2. 試劑盒保質(zhì)期12個月。每次使用時,請取出實驗所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量,置于冰浴條件下并在8小時內(nèi)使用;剩余部分,請置于存儲條件下。
DNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎(chǔ)型) | WLB8201KIT | 48份/盒 | 3300 |
DNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型) | WLE8202KIT | 48份/盒 | 3300 |
DNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型) | WLN8203KIT | 48份/盒 | 3300 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒(膠體金試紙條型) | WLRN8206KIT | 48份/盒 | 3360 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎(chǔ)型) | WLRB8204KIT | 48份/盒 | 3360 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒(熒光型) | WLRE8205KIT | 48份/盒 | 3360 |
HybriDetect試紙條 | WLFS8201 | 50條/包 | 1500 |