TRzol LS（液體樣本 RNA 提取試劑）

儲(chǔ)存條件：
TRzol LS 在室溫下能穩(wěn)定保存 12 個(gè)月。盡管如此，為達(dá)到效果，我們建議保存在 2-8°C 的環(huán)境下。
重要提示：
有毒物接觸皮膚或者不慎吞服，會(huì)導(dǎo)致灼傷。一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。若感不適，看醫(yī)生并尋求和其他成分的正確治療方案。
產(chǎn)品介紹：

TRzol LS試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層、中間層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來回收。無論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌，該方法對(duì)少量及大量的組織和細(xì)胞均有較好的分離效果。TRzol LS 試劑操作上的簡單性允許同時(shí)處理多個(gè)樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRzol 抽提的總 RNA 能夠避免DNA 和蛋白的污染，可用于 RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+篩選、體外翻譯、RNA 酶保護(hù)分析和分子克隆。如果是用于 PCR，當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí)，建議用擴(kuò)增級(jí)的DNase I 來處理抽提的總RNA。

注意事項(xiàng)：
1.從少量的組織(1~10mg)或細(xì)胞(10 2-10 4 個(gè))中分離RNA 樣品：往組織或細(xì)胞中加 入 800µl TRzol。待樣品裂解后，加入氯仿并進(jìn)行步驟 2 中的抽提操作。在用異丙醇沉 淀 RNA 之前，加入 5~10μg 無 RNA 酶的glycogen 作為水樣層的載體。為降低其黏度 在加入氯仿前用 26 號(hào)注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。Glycogen 會(huì)留在水樣層中 并和 RNA 共析出。在濃縮到 4mg/ml 之前它不會(huì)抑制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)鏈的合成也不會(huì) 抑制 PCR。

2.在勻漿化后和加入氯仿之前，樣品可以在-60℃或者-70℃保存至少一個(gè)月。將 RNA 沉淀溶于 75%的乙醇在 2-8℃至少可以保存一周，在-5—-20℃下至少可保存一年。

3.用 TRzol LS 抽提 RNA 時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通 風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無例外，室溫保持在 15~30℃的條件下。

自備試劑：

氯仿 、 異丙醇、75%乙醇(RNase-Free water 配制)、RNase-Free water（將水加入 無 RNA 酶的玻璃瓶中，加入 DEPC 至 0.1% (V/V)。放置過夜并高壓滅菌）。0.5% SDS 溶液(RNase-Free water 配制)（可選）。

操作步驟：

1.樣品預(yù)處理 a.生物液體 每0.25ml液體樣品(血清，血漿等等)加入0.75ml TRzol LS，用加樣槍吹打液體樣品 幾次以幫助裂解樣品中細(xì)胞。每5~10×10 6個(gè)細(xì)胞至少加入0.75ml TRzol LS。對(duì)于含有高 污染物樣品如全血樣品，可以用滅菌水按照1：1比例稀釋一倍后開始提取。TRzol LS 和液體樣品的終體積比總是3：1。 b.組織 用glass或強(qiáng)力勻漿器攪勻組織樣品，每50~100mg組織或者0.25ml組織懸液加 0.75ml的TRzol LS。一般50~100mg組織體積都要小于0.25ml，如果組織樣品的體積小 于0.25ml，加入滅菌水將組織樣品體積調(diào)整到0.25ml以保證體積比例是3：1。 c.單層生長的細(xì)胞 直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板中加入0.3ml-0.4ml的TRzol LS溶解細(xì)胞，用加樣槍吹打 幫助充分裂解細(xì)胞。依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來決定所需的TRzol LS 量 （每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因?yàn)榕囵B(yǎng)板中附著殘留的培養(yǎng)液 已經(jīng)充分稀釋了TRzol LS 。 d.懸浮生長的細(xì)胞 通過離心來沉淀細(xì)胞。在TRzol LS試劑中用移液管反復(fù)吹打來裂解細(xì)胞。每 5~10×10 6的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每1×10 7細(xì)菌加0.75ml的TRzol LS。和步驟 b 一樣用滅菌水調(diào)節(jié)樣品體積到0.25ml。在加入TRzol LS前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞，因?yàn)槟?樣會(huì)增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細(xì)菌可能需要使用勻漿器。 2.分離階段 將勻漿樣品在15-30°C條件下孵育5min以使核蛋白體分解。每0.75ml TRzol LS 加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在室溫下孵育2~15 min。 在2~8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15 min。離心后混合物分成三層： 下層-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。 水樣層的容量大約為所加TRzol LS 容量的70%。

2.RNA 的沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，如果希望分離DNA和蛋白，有機(jī)層和中間層同 樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。每0.75ml TRzol LS對(duì)應(yīng)0.5ml 異丙醇。將混合的樣品在15-30°C條件下孵育10min并在2~8°C下以不超過12,000×g的離 心力高速冷凍離心10 min。RNA沉淀在離心前通常不可見，離心后會(huì)形成一膠狀片狀 沉淀附著于試管壁和管底。

3.RNA 的漂洗 移去上層懸液。用75%的乙醇(RNase-Free water配制)洗滌RNA沉淀一次，每0.75ml 的TRzol LS至少加1ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2~8°C下以不超過7,500×g的 離心力高速冷凍離心5 min。

4.RNA 的再溶解 室溫簡單干燥 RNA 沉淀，不要在真空管里離心干燥 RNA。尤為重要的是，不能讓 RNA 沉淀干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 樣品其 OD260 /OD280 比值<1.6 。用移液管分幾次移取 RNase-Free water 或 0.5%SDS 溶液 (RNase-Free water 配制)來溶解RNA（如果RNA 以后要用于酶切反應(yīng)時(shí)，避免使用SDS。） RNA 還能被 甲酰胺（除去離子）再溶解并保存在-70°C。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。