1.百螢 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性細(xì)胞凋亡復(fù)用檢測試劑盒概述

我們的Cell Meter 檢測試劑盒是一套用于檢測細(xì)胞生存力的工具。 有多種參數(shù)可用于檢測細(xì)胞活力。 胱天蛋白酶被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的可靠指標(biāo)。 該特定試劑盒設(shè)計(jì)為使用三種不同的熒光色同時(shí)監(jiān)視與細(xì)胞凋亡有關(guān)的四個(gè)關(guān)鍵半胱天冬酶（caspase-3 / 7、8和9）。 該試劑盒使用DEVD-ProRed，IETD-R110和LEHD-AMC作為分別指示caspase 3 / 7、8和9活性的熒光指示劑。 在半胱天冬酶裂解后，DEVD-ProRed ，IETD-R110和LEHD-AMC半胱天冬酶底物會(huì)產(chǎn)生三種不同的熒光團(tuán)：ProRed （紅色熒光），R110（綠色熒光）和AMC（藍(lán)色熒光）。

2.百螢 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性細(xì)胞凋亡復(fù)用檢測試劑盒適用儀器

熒光酶標(biāo)儀

Ex(nm)      見表一

Em(nm)      見表一

推薦孔板    黑色透明底板

讀取模式    底部/頂部讀取

表1. Caspases 3/ 7、8和9的光譜波長

3.百螢 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性細(xì)胞凋亡復(fù)用檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1. 用測試化合物準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 加入等量的半胱天冬酶工作溶液

3. 在室溫下孵育30分鐘至1小時(shí)

4. 檢測熒光強(qiáng)度

溶液配制

工作溶液配制

1.單胱天蛋白酶活性工作液：將50 µL底物（組分A，B或C）加入10 mL分析緩沖液（組分D）中，制成caspase 3/7，caspase 8或caspase 9工作溶液，并充分混合。

2.雙胱天蛋白酶或三胱天蛋白酶活性工作液：將每種半胱天冬酶底物50 µL加到10 mL的測定緩沖液（組分D）中，制成工作溶液。 注意：請按比例準(zhǔn)備被測底物溶液和所需的體積。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.通過向PBS或所需的緩沖液中加入10 µL /孔的10X測試化合物（96孔板）或5 µL /孔的5X測試化合物（384-板）來處理細(xì)胞。對于空白孔（不含細(xì)胞的培養(yǎng)基），添加相同量的化合物緩沖液。

2.將細(xì)胞板在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育（對于用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞需要3-5小時(shí)）以誘導(dǎo)凋亡。

3.加入100 µL /孔/ 96孔或25 µL /孔/ 384孔的所需caspase分析工作溶液。

4.在避光的條件下，在室溫下孵育平板至少30至60分鐘。注意：如果需要，可在室溫下添加測定上樣溶液10分鐘之前，向選定的樣品中添加1 µL 1 mM caspase抑制劑，以確認(rèn)對caspase活性的抑制。

5.按照頂部或底部讀取模式，檢測熒光強(qiáng)度。注意：有時(shí)，底部讀數(shù)可提供更好的信噪比，如果使用底部讀數(shù)模式，則以800 rpm的速度離心細(xì)胞板（特別是非貼壁細(xì)胞）2分鐘（制動(dòng)）。

圖示：

圖1. Jurkat細(xì)胞中胱天蛋白酶活性的檢測。 當(dāng)天將Jurkat細(xì)胞以200,000個(gè)細(xì)胞/孔的方式接種在Costar黑色96孔板中。用星形孢菌素以1 mM的終濃度處理細(xì)胞4小時(shí)（紅色條），而未處理的細(xì)胞用作對照（藍(lán)色條）。 添加單胱天蛋白酶測定加載溶液（100 uL /孔）（對于caspase 3/7在＃1中，對于caspase 8而言在＃2中或?qū)τ赾aspase 9在＃3中）或三次胱天蛋白酶測定加載溶液（對于caspase 3在＃4中 一起添加/ 7、8和9），并在室溫下孵育1小時(shí)。 使用FlexStation熒光酶標(biāo)儀在波長下測量熒光強(qiáng)度。 胱天蛋白酶3 / 7、8和9的活性可以在一次測定中檢測到，而不受其他胱天蛋白酶的干擾。

圖2. cSBL通過caspase途徑誘導(dǎo)H2452和MSTO細(xì)胞凋亡。 通過蛋白質(zhì)印跡法（A，B）或熒光法（C，D）檢測到Caspase-3，-8和-9的活化。 熒光測定法獨(dú)立進(jìn)行三次，數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。 這些實(shí)驗(yàn)與對照相比的統(tǒng)計(jì)顯著性顯示如下：* P<0.05，** P <0.01，*** P <0.001。 來源：Tatsuta T等人，PLOS，2018年1月，來自牛蛙卵的唾液酸結(jié)合凝集素在體外和體內(nèi)抑制人惡性間皮瘤細(xì)胞生長。