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Caspase 9活性細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于細(xì)胞凋亡的試劑盒，Cell Meter檢測(cè)試劑盒是一類用于檢測(cè)細(xì)胞功能的系列工具，包括細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞膜電位以及細(xì)胞周期等方面的指標(biāo)。每種檢測(cè)方案均能提供不同熒光顏色的檢測(cè)方案。這些高效的檢測(cè)方案為從多角度研究細(xì)胞功能活動(dòng)提供了一種十分有效的方法。該檢測(cè)試劑盒 *藍(lán)色熒光* 是通過測(cè)量Caspase 9的活性而用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)的。Caspase 9是CED-3亞家族中的一員。活化的Caspase 9能切割下游caspases,例如caspase-3,-6和-7，起始Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在正常發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，活化的Caspase 9是凋亡所必需的。Caspase 9具有底物的選擇性，其識(shí)別底物基序?yàn)長(zhǎng)eu-Glu-His-Asp (LEHD)。本試劑盒利用Ac-LEHD-ProRed 作為熒光指示器來檢測(cè)caspas-9的活性。通過caspas-9的切割ProRed 產(chǎn)生強(qiáng)藍(lán)色熒光，EX/Em = 350/450 nm。這種特性使得試劑盒能適合于DAPI濾光器。本試劑盒提供所有必需組分。該實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、快速且適應(yīng)高通量篩選的需求。它不僅能夠定量凋亡細(xì)胞中caspas-9的活性還能篩選caspas-9的抑制劑。很多實(shí)驗(yàn)室利用本試劑盒進(jìn)行高通量抑制劑的篩選。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供的Caspase 9活性細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 。

樣本實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1.用測(cè)試化合物（100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板）制備細(xì)胞
2.加入等體積的Caspase 8工作溶液（100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板）
3.在室溫下孵育1小時(shí)
4.在Ex / Em = 535/620 nm（截止= 610 nm）監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度（頂部或底部讀取模式）

工作溶液配制

將5μL的200X Ac-LEHD-ProRed 儲(chǔ)備溶液（組分A）加入1mL的分析緩沖液（組分B）中并充分混合以制備Caspase 9工作溶液。避光。注意：Caspase 9工作液不穩(wěn)定，請(qǐng)及時(shí)使用。 1 mL Caspase 9工作溶液足以進(jìn)行10次分析。有關(guān)細(xì)胞樣品制備的指南，請(qǐng)點(diǎn)擊查看。

操作步驟

1.通過將10μL/孔的10X測(cè)試化合物（96孔板）或5μL/孔的5X測(cè)試化合物（384-板）加入PBS或所需緩沖液中來處理細(xì)胞。對(duì)于空白孔（沒有細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相同量的化合物緩沖液。

2.將細(xì)胞板在37℃，5％CO2，培養(yǎng)箱中孵育所需的一段時(shí)間（對(duì)于用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞3-4小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.添加100μL/孔/ 96孔或25μL/孔/ 384孔板的Caspase 9工作溶液。

4.將板在室溫下孵育至少1小時(shí)，避光。注意：如果需要，在室溫下加入Caspase 9工作溶液10分鐘前，向選定的樣品中加入1μL的1 mM Ac-LEHD-CHO caspase 9抑制劑，以確認(rèn)抑制caspase 9樣活性。

5.在Ex / Em = 540 / 620nm（cutoff= 610nm）下用熒光酶標(biāo)儀（頂部或底部讀取模式）監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。注意：有時(shí)，底部讀數(shù)會(huì)提供更好的信號(hào)背景比。如果使用底部讀取模式，則以800rpm離心細(xì)胞板（特別是對(duì)于非貼壁細(xì)胞）2分鐘。