脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒規(guī)格：

質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn) pH：7.2~7.4 

內(nèi)毒素含量：＜10 EU/mL 

生物安全：細(xì)菌、真菌、支原體檢測(cè)陰性 

質(zhì)量檢測(cè)：誘導(dǎo)測(cè)試合格

| 檢驗(yàn)原理 

阿利辛藍(lán)廣泛用于酸性多糖的染色，如軟骨 或組織中的糖胺聚糖和細(xì)胞分泌的外被多糖的 染色等。干細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，會(huì)逐漸 向軟骨細(xì)胞方向分化。軟骨細(xì)胞外具有一層富含 蛋白多糖的基質(zhì)，是成軟骨分化的標(biāo)志物，可被 阿利辛藍(lán)染成藍(lán)綠色。

 成軟骨誘導(dǎo)分化操作（平面誘導(dǎo)） 

1. 細(xì)胞分化誘導(dǎo) 

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化下來(lái)計(jì)數(shù)，成軟骨 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液重懸細(xì)胞，離心后調(diào)整細(xì) 胞密度密度1.0~2.0×10e7cells/mL。 吸取20 μL細(xì)胞懸液（約2.0~4.0×10e5個(gè)細(xì)胞） 懸滴至24孔板。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境 下培養(yǎng)2~3 h使細(xì)胞貼壁。 2~3 h后補(bǔ)充1 mL成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘 導(dǎo)液正常培養(yǎng)。每隔2~3天換液一次。按照以上 換液頻率誘導(dǎo)21~28天，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變 化。 

2. 染色鑒定 

2.1 細(xì)胞固定 吸去培養(yǎng)基使用適量 1×PBS 清洗一次，棄去 后取適量 4%中性覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室 溫固定 30~60 min 后，棄去固定液再使用 1×PBS 清洗兩次。

 2.2 阿利辛藍(lán)染色 向清洗干凈的誘導(dǎo)孔內(nèi)加入適量染色液，避 光靜置染色 30 min。 吸去阿利辛藍(lán)染色液，用 1×PBS 清洗兩次， 并加入適量 1×PBS 避免細(xì)胞干燥。

 2.3 誘導(dǎo)評(píng)估 顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進(jìn)行圖像 采集和誘導(dǎo)評(píng)估。誘導(dǎo)成功時(shí)，軟骨組織中的內(nèi) 酸性粘多糖可被阿利辛藍(lán)染成藍(lán)綠色。

 1. 干細(xì)胞的準(zhǔn)備 

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化下來(lái)計(jì)數(shù)，取 3×10e5 個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中，250 g 離 心 4 min。 棄上清，加入 0.5 mL 成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基 預(yù)混液，重懸細(xì)胞，150 g 離心 5 min。小心棄去 上清，加入 0.5 mL 成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo) 液，重懸細(xì)胞，150 g 離心 5 min。 將 15 mL 離心管的管蓋稍稍旋開(kāi)，放置于 37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。

 2. 細(xì)胞分化誘導(dǎo) 

24 h 后觀察細(xì)胞沉淀形變團(tuán)聚的情況，如有 明顯的變化，則小心輕柔地?fù)軇?dòng)管底，嘗試讓細(xì) 胞團(tuán)脫離管底，全部浸潤(rùn)在誘導(dǎo)液中。 置于 37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約 21 天， 通常每 2 天更換一次新鮮配制的成軟骨誘導(dǎo)分化 培養(yǎng)基誘導(dǎo)液。注意觀察細(xì)胞團(tuán)成球情況及表面 光滑度，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間，并進(jìn)行染色 鑒定。

 3. 染色鑒定 

3.1 軟骨球固定 將軟骨球從離心管中轉(zhuǎn)移至 EP 管，并使用 1 ×PBS 清洗兩次，最后置于適量的 4%中性中。

 3.2 石蠟包埋切片 軟骨球經(jīng)石蠟包埋后切片。 

3.3 阿利辛藍(lán)染色 將石蠟切片脫蠟和脫水，使用阿利辛藍(lán)染色 液染色 30 min，用自來(lái)水沖洗 2 min，蒸餾水沖 洗 1 次。 

3.4 誘導(dǎo)評(píng)估 顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進(jìn)行圖像 采集和誘導(dǎo)評(píng)估。誘導(dǎo)成功時(shí)，軟骨組織中的內(nèi) 酸性粘多糖可被阿利辛藍(lán)染成藍(lán)綠色。 

NOTE: 干細(xì)胞的成軟骨分化水平因細(xì)胞類型、細(xì)胞供體 來(lái)源，培養(yǎng)條件、細(xì)胞代次、細(xì)胞狀態(tài)和分化時(shí)間等因素而異。