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廣州健侖生物科技有限公司
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登革熱IgM試劑盒
登革熱IgM試劑盒說明書（捕獲法）
【】
應用范圍
DENV Detect IgM Capture ELISA是一種用來檢測人是否感染登革熱病毒的ELISA檢測系統(tǒng)，它可以檢測出人血清中是否存在抗登革熱病毒源性重組抗原（DENVRA）的IgM抗 體。此診斷實驗用于有登革熱發(fā)熱或是登革熱血熱臨床癥狀的病人檢測。陽性結果必須經過蝕斑減少中和試驗（PRNT）或是根據CDC疾病診斷指南確證。
用于臍帶血檢測，新生兒測試，*，或是普通人群篩查的實驗特征性能還未建立。此試驗未經FDA明確證明可用于血液或血漿捐獻者的檢測。
注意：試驗中需觀察西尼羅河或是其他病毒中的IgM是否會與登革熱試劑盒發(fā)生交叉反應，如可能發(fā)生了交叉反應，則視為警告狀態(tài)
實驗原理
DENV Detect IgM ELISA試劑盒是由一種酶聯擴大的兩步法免疫檢測系統(tǒng)。在此實驗中，將登革熱陰性質控、陽性質控和未知濃度的血清樣品用樣品稀釋液稀釋，然后加入到包被 了抗人IgM抗體的微孔中溫育，之后分別加入登革熱源性重組抗原DENVRA和正常細胞抗原（NCA）進行溫育。溫育并洗板后，用HRP標記的DEN特異 性抗體處理。第二次溫育并洗板后，加入TMB底物液進行溫育。之后再加入酸性終止液，450nm處測OD值可確定底物反應的程度。當高于一定數值時（臨界 值），樣品的吸光度值可確定樣品中是否存在登革熱抗體。
注意：陰性質控和弱陽性質控以內在質控形式提供，其目的是為了監(jiān)測試劑盒成分的完整性。
試劑盒成分
登革熱IgM ELISA試劑盒提供了足夠做96個測試所需要的試劑。試劑盒成分如下：
登革熱檢測特定材料：
1）抗人IgM包被的包被板：帶板蓋的板架，包被有抗人IgM， 96孔，2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。
2）樣品稀釋液：1瓶，25ml，即用，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，0.05%的Proclin防腐劑和添加劑，用于試驗樣品，陽性和陰性質控的稀釋，2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定
3）即用型的登革熱重組性抗原（DENRA）：1瓶，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.05%的Proclin防腐劑，抗生素（0.0025-0.004% G418 硫酸鹽），登革熱重組抗原和添加劑， 2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。
4）即用型正常細胞抗原（NCA）：1支，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.05%的Proclin防腐劑，COS-1細胞的上清， 2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。
5）登革熱陰性質控：1支，50ul陰性血清，登革熱陰性質控可輔助監(jiān)測試劑盒的完整性。2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。
6）登革熱IgM陽性質控：1支，50ul含0.03%的proclin的陽性血清，登革熱陽性質控可輔助監(jiān)測試劑盒的完整性。2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。
7）10倍濃縮洗滌液：1瓶，120ml，含吐溫20的10倍濃縮的磷酸緩沖鹽，2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。
8）HRP標記的即用型酶聯物，1瓶，6ml，HRP標記的黃熱病毒活性單克隆抗體，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.01%的硫柳汞防腐劑和添加劑，2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。
9）Enwash：1瓶，20ml，即用，含吐溫20的磷酸緩沖鹽， 2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定
10） TMB底物液：1瓶，9ml液態(tài)底物液，即用，2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。注意：底物液必須始終儲存于避光試劑瓶中。
11） 終止液：1瓶，內含6ml即用型的終止液，1N的硫酸，2-8℃下儲存，有效期內穩(wěn)定。注意：強酸，請戴保護手套、口罩和安全鏡，按照安全條例處理所有的材料。
實驗所需器材但試劑盒不提供
1）可在450nm處讀數的酶標儀
2）生物學或高純度水
3）真空泵
4）洗板機
5）37℃無CO2的孵箱
6）1-10ul的單道移液器，50-200ul的單道和多道移液器。
7）聚丙烯試管
8）Parafilm封口膜
9）計時器
10） 旋渦混合器
樣品的采集與準備
1）此實驗必須用血清來做。全血和血漿樣本不能直接檢測。
2）不要將不同批次的試劑混亂
3）不要加熱熱滅活的試驗血清
4）實驗前將所有試劑平衡至室溫，溫度的改變會對試驗有影響
5）避免反復凍融樣品血清
6）直接用干凈的槍頭從試劑瓶中移去試劑，不能轉移，避免污染
7）不用的板條應立即放回至密封袋中保存
8）不要使用任何過期的試劑
9）避免試劑暴露受熱或陽光直射
10） 有些試劑可能會產生沉淀，使用前一定要混勻
11） 洗滌過程不完整會對試驗結果產生影響
12） 為了減少由于孵育時間的差異而引起的漂移，建議底物液和終止液加入的時間和速度要*
13） 避免試劑中有微生物污染，尤其是酶聯物
14） 每一次吸取試劑，標準品，質控品時都應用干凈的槍頭
實驗步驟
將所有的試劑成分和樣品都平衡至室溫。實驗前反復倒置以混合試劑和樣品。
試劑準備：
1）1X洗滌液的配制：用生物學或高純度水將10倍濃縮型的洗滌液稀釋成1X的洗滌液。為了制備即用型的洗滌緩沖 液，我們可以將120ml 10倍濃縮的洗滌液加入到1080ml蒸餾水或去離子水中，沖洗掉所有晶體，旋渦混合溶液以至所有晶體都溶解掉。制備好的洗滌液可在室溫下穩(wěn)定儲存6個 月。使用前請檢查洗滌液是否被污染。
2）包被板的準備：將實驗所需數目的板條置于板架上。將剩余的板條立即裝入包裝袋中，并儲存于2-8℃的環(huán)境下，有效期內穩(wěn)定。
操作步驟：
1）陽性質控、陰性質控都必須做雙份檢測,DENRA和NCA都要檢測，未知血清樣品可做一份或雙份，DENRA和NCA都要檢測，按照說明書上的操作流程圖進行操作。
2）將實驗中使用的板條標記好。
3）用試劑盒提供的樣品稀釋液將血清和質控品稀釋100倍。用小聚丙烯試管進行稀釋，稀釋時至少需要4ul血清、陽性質控和陰性質控。如：4ul血清加396ul稀釋液。
4）用單道或多道移液器將稀釋好的血清、陰性質控和陽性質控各50ul加入到相應的微孔中。注意，所有的樣品都必須用DENRA和NCA檢測。
5）用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。
注意：這樣是為了保證溫度的分布在每個孔的底部和邊緣同等地散播。一旦頂部密封阻礙了蒸發(fā)，任何多余的封板膠必需被剪掉。
6）37℃下孵育1小時。注意：不要將微孔板疊放，必須單獨地分層平輔。這對于溫度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何氣體，不要讓板條接觸任何濕潤的物質，如濕紙巾等。
7）溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
8）在A-D列中加入50ul DENRA，在E-H列中加入50ul NCA。
9）用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。（同步驟5）
10） 37℃下孵育1小時。（同步驟6）
11） 溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
12） 用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP標記的酶聯物。
13） 用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。（同步驟5）
14） 37℃下孵育1小時。（同步驟6）
15） 溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
16） 用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。
17） 室溫下溫育（無需蓋板）5min。
18） 溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
19） 用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。
20） 室溫避光溫育10min。
21） 溫育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul終止液，室溫溫育1min。
22） 溫育后，450nm處測 OD值。
質量控制
每一試劑中均含有陰性和陽性質控血清，這些質控可接受的免疫指數（ISR）值會在以下的詳細表格中說明，陰性質控和陽性質控是用于監(jiān)測試劑的實 質性錯誤，陽性質控并不保證試劑臨界值的精確性。如果任一質控的ISR值不符合說明書，則本次實驗是無效的必須重做，如果實驗是無效的，病人的結果不能公 布。質量控制的執(zhí)行必須與地方的，國家的或聯盟規(guī)則要求和你實驗的質量控制程序標準相*，建議使用者參照NCCLS C24A和42CFR493、1256作為質量控制實踐的指引。以下的結果僅作為例子。
陰性質控的計算：計算DENRA和NCA的登革熱病毒陰性質控值。
例如：登革熱陰性質控
DENRA NCA
0.108 0.066
No 2 0.082 0.061
總和 0.190 0.127
平均值（DENRA）= 0.190÷2 = 0.095
（NCA） = 0.127 ÷ 2 = 0.064
計算DENRA/NCA的比例： 0.095÷0.064 = 1.48
登革熱陰性質控的計算DENRA/NCA比例高于1.65，則實驗必須重做。
陽性質控的計算：計算NCA和DENRA的登革熱IgM陽性質控。
例如：登革熱陽性質控
DENVRA NCA
0.635 0.105
No 2 0.655 0.115
總和 1.290 0.220
平均值（DENVRA）= 1.290÷2 = 0.645
（NCA） = 0.220 ÷ 2 = 0.110
計算DENVRA/NCA的比例： 0.645÷0.110 = 5.86
登革熱陰性質控的計算DENVRA/NCA比例低于5.0，則實驗必須重做。
為了能出具實驗報告，實驗結果必須滿足下列表格的要求。如果實驗結果不能*下列要求，則說明試劑退化了或者實驗步驟出現了問題，實驗必須重做。
說明：本公司為澳大利亞Panbio公司系列產品中國地區(qū)總代理。此本中文版說明書是由廣州健侖生物科技有限公司研究人員翻譯，過程中如有錯漏之處，請以廠家英文版說明書為準.謝謝！
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