三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中*侵襲性的一種，由于不表達激素受體以及HER2，無法使用靶向治療，長期以來TNBC患者只能接受手術以及放化療

免疫檢查點抑制劑療法的出現(xiàn)為TNBC患者帶來了新的希望，然而臨床試驗發(fā)現(xiàn)PD-1抑制劑聯(lián)合化療僅能使一小部分TNBC患者獲益[1,2]。因此，探究TNBC對免疫檢查點抑制劑治療耐藥的機制至關重要，這將為改善免疫治療效果提供參考。

近期，由Dana-Farber癌癥中心Judith Agudo教授帶領的研究團隊在Cell期刊發(fā)表重要研究成果[3]，他們發(fā)現(xiàn)在TNBC中有一群抵抗T細胞殺傷的靜息腫瘤細胞（QCCs）。這些QCCs通過激活HIF1a，與免疫抑制性成纖維細胞、功能失調的DC細胞一起形成了一個抵御T細胞浸潤與殺傷的微環(huán)境。從而在免疫治療中存活下來并引起腫瘤復發(fā)。

這項研究成果為我們揭開了乳腺癌免疫逃逸的神秘面紗，突出了QCCs在乳腺癌免疫逃逸中的重要作用，提示我們靶向清除QCCs可能是破解TNBC免疫耐藥難題的有效途徑。

以往有研究發(fā)現(xiàn)一些基因在腫瘤細胞抵抗免疫治療中具有一定作用[4,5]，但是這些研究并不能解釋腫瘤細胞是如何營造出一個免疫抑制性微環(huán)境的；此外，通過測序的手段能夠找到對免疫檢查點抑制劑治療耐藥腫瘤所具備的一些特征，但是腫瘤組織中存在大量異質性的細胞群體，這大大增加了尋找腫瘤耐藥機制的難度。例如丟失腫瘤抗原的癌細胞與腫瘤抗原陽性的癌細胞在逃脫免疫系統(tǒng)追殺過程中采取的方法顯然是不同的。

在這項研究中，Agudo教授團隊希望探究那些表達腫瘤抗原的癌細胞是怎么逃脫免疫系統(tǒng)的追殺的。因此，他們?yōu)樾∈蠼臃N了表達GFP或mCherry的TNBC細胞系4T07，并為小鼠轉輸特異性識別GFP的PD-1-/-Jedi T細胞(敲除PD-1是為了模擬PD-1抑制劑治療)。由于Jedi T細胞的TCR只能特異性識別GFP而不能識別mCherry。因此該實驗模型可以用來探究持續(xù)表達腫瘤特異性抗原的腫瘤細胞(GFP+腫瘤細胞)是如何逃脫腫瘤抗原特異性T細胞(Jedi T細胞)的攻擊。

研究團隊在轉輸Jedi T細胞后第5天分析腫瘤內GFP+與mCherry+腫瘤細胞的比例，發(fā)現(xiàn)Jedi T細胞殺死了大部分GFP+腫瘤細胞，但是仍然有一部分GFP+腫瘤細胞逃脫了T細胞的殺傷。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)這些逃脫殺傷的GFP+腫瘤細胞形成了一個細胞簇，在細胞簇內部T細胞浸潤水平降低了兩倍。這說明幸存的GFP+腫瘤細胞簇能夠阻止T細胞的浸潤，這可能是導致其對免疫治療產生抵抗的原因之一。

Jedi T細胞攻擊后存活的GFP+腫瘤細胞聚集成簇

接下來，Agudo教授團隊分析了幸存的GFP+腫瘤細胞與對照mCherry+腫瘤細胞的轉錄組差異。他們發(fā)現(xiàn)，與mCherry+腫瘤細胞相比，GFP+腫瘤細胞中與細胞周期相關的基因明顯下調。EdU（胸腺嘧啶核苷類似物5-乙炔-20-脫氧尿苷）摻入實驗表明這些在Jedi T細胞攻擊后存活的GFP+腫瘤細胞處于細胞周期停滯狀態(tài)（稱為靜息腫瘤細胞，QCCs）。

那么這些QCCs是否對T細胞的殺傷更具抗性呢？研究團隊向腫瘤細胞中轉入tdTomato-p27K，這可以使QCCs被tdTomato標記。向荷瘤小鼠轉輸PD-1-/- Jedi T細胞后發(fā)現(xiàn)，相比于對照非免疫原性miRFP670+腫瘤細胞，存活下來的GFP+腫瘤細胞大部分都是tdTomato+的，這說明QCCs對T細胞的殺傷具有更強的抵抗能力。

在Jedi T細胞攻擊中存活下來的GFP+腫瘤細胞處于細胞周期靜息狀態(tài)，并對T細胞的殺傷具有更強的抵抗力

以上的結果表明在小鼠模型中，QCCs是免疫治療耐藥的主力，那這種現(xiàn)象在人類患者中是否也存在呢？通過分析乳腺癌患者組織病理樣本以及轉錄組測序，研究院隊發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中與T細胞接觸的腫瘤細胞大多是Ki67+的增殖細胞，p27+的QCCs極少與T細胞接觸；同時基因集富集分析表明，與治療無應答者相比，免疫治療應答患者的腫瘤細胞在DNA復制相關通路更加富集，表明它們處于非靜止狀態(tài)。這種相關性提示我們，QCCs可能與乳腺癌患者免疫治療效果不佳有關。

乳腺癌患者腫瘤組織中靜息腫瘤細胞周圍T細胞浸潤較少，并且對免疫治療有應答的患者其腫瘤細胞處于細胞周期活躍狀態(tài)

為了探究QCCs的耐藥機制，研究團隊對QCCs以及非靜止腫瘤細胞進行RNA測序。數(shù)據(jù)分析表明，QCCs上調了缺氧以及葡萄糖代謝相關通路基因。免疫熒光染色結果顯示，p27K+QCCs與缺氧探針共定位，而T細胞則很少浸潤至缺氧區(qū)域；Jedi T細胞治療后幸存的GFP+腫瘤細胞也位于低氧區(qū)域中。這些數(shù)據(jù)表明乳腺癌中的QCCs主要位于T細胞浸潤較少的缺氧微環(huán)境中。

QCCs所在區(qū)域處于明顯的低氧狀態(tài)，并且T細胞浸潤較少

接下來，為了在單細胞水平上分析QCCs抑制T細胞功能的機制，Agudo教授團隊分離了QCCs細胞簇內外的浸潤細胞，并對其進行單細胞轉錄組測序。

通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，QCCs細胞簇內部存在大量免疫抑制性成纖維細胞，這解釋了為何QCCs區(qū)域浸潤T細胞數(shù)目較少。

對QCCs細胞簇內外浸潤T細胞進行分析發(fā)現(xiàn)，浸潤在缺氧的QCCs細胞簇內部的CD8+ T細胞耗竭程度更深，殺傷能力更弱。

QCCs細胞簇內部存在大量免疫抑制性成纖維細胞，浸潤的T細胞數(shù)量顯著低于QCCs細胞簇外，并且QCCs細胞簇內浸潤的T細胞耗竭程度更高

究竟是哪群細胞促進了T細胞的功能失調呢？通過對QCCs內部浸潤各細胞亞群進行缺氧特征評分，研究團隊發(fā)現(xiàn)DC細胞表達豐富的缺氧相關基因，并且下調促進T細胞活化的基因，如MHCⅠ與MHCⅡ、IL-12、CD80/86，表明這些DC細胞促進T細胞活化的能力極大地減弱了，這可能是QCCs細胞簇內部浸潤的T細胞功能失調的重要原因。

但是Agudo教授團隊通過缺氧誘導實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧并不能直接削弱DC細胞活化T細胞的能力，所以研究團隊將目光轉向QCCs本身。探究是否是表達HIF1a的QCCs塑造了免疫抑制性的微環(huán)境，損傷DC細胞活化T細胞的能力進而抑制了T細胞免疫應答。為此，他們構建了表達活化型HIF1a(HIF1aSTBL)的乳腺癌細胞系。

荷瘤實驗顯示，相比于WT腫瘤，表達HIF1aSTBL的腫瘤內浸潤的T細胞數(shù)量更少，耗竭程度更深；瘤內DC細胞上MHCⅡ表達明顯下調，這些現(xiàn)象與在QCCs細胞簇內部觀察到的基本一致。

更進一步地，研究團隊將WT或表達HIF1aSTBL的GFP+腫瘤細胞與mCherry+腫瘤細胞混合接種至小鼠皮下。發(fā)現(xiàn)相比于mCherry+: GFP+腫瘤組，接種了mCherry+: GFP+ HIF1aSTBL腫瘤細胞的小鼠瘤內浸潤T細胞數(shù)量更少，并且T細胞更難接近GFP+腫瘤細胞，存活的GFP+腫瘤細胞的數(shù)量增加了數(shù)倍，可見HIF1a能夠促進腫瘤細胞免疫逃逸。

腫瘤細胞過表達HIF1aSTBL后能夠抑制T細胞的浸潤并逃脫T細胞的攻擊

綜合以上數(shù)據(jù)可見，QCCs正是通過高表達HIF1a從而來營造一個免疫抑制性的微環(huán)境，逃脫腫瘤抗原特異性CD8+T細胞的追殺。那么敲除腫瘤細胞中的HIF1a是否就能夠促進T細胞對腫瘤的殺傷呢？實驗結果表明敲除腫瘤細胞中的HIF1a后，腫瘤內浸潤T細胞數(shù)量顯著增加并且耗竭程度降低，腫瘤體積明顯減小。這提示我們靶向腫瘤內HIF1a能夠促進抗腫瘤免疫應答，抑制腫瘤生長。

敲除腫瘤細胞中的HIF1a顯著增強了抗腫瘤免疫應答

總的來說，這項研究揭示了腫瘤抗原陽性的癌細胞免疫逃逸的機制：它們聚集成團，召喚成纖維細胞為它們筑起屏障；一起進入靜息狀態(tài)并高表達HIF1a，使得免疫系統(tǒng)的哨兵——DC細胞功能失調，進而抑制T細胞免疫應答。這些努力使得它們得以逃脫T細胞的追殺，并在免疫治療后卷土重來。