人心型脂肪酸結合蛋白酶聯(lián)免疫試劑【工作原理】
心型脂肪酸結合蛋白(heart-type fatty acid binding protein,H-FABP)是心肌細胞中富含的一種小分子（15KDa）細胞質蛋白質,參與脂質體內平衡。H-FABP含量在骨骼肌中比心肌中低10倍，在腎臟、肝臟和小腸中含量更低。心肌損傷后，H-FABP釋放至細胞外，出現(xiàn)于血流中，血漿H-FABP大量升高與梗塞面積間也有良好的相關性。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體，經(jīng)*（biotin）標記。樣品和*標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。
人心型脂肪酸結合蛋白酶聯(lián)免疫試劑【注意事項】
1． 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
2． 配制各種試劑時，切記混勻！
3． 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
4． 建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。
5． 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活！
6． 為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。
【樣品的準備和保存】
樣品如果不立即分析，應分裝后冷凍保存，且避免反復凍融。
血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時或4℃過夜，離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
B．*標記抗體工作液：在使用前2小時內準備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul*標記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。
C．親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內準備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。
D. TMB顯色工作液的準備：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比列配制TMB顯色工作液
【操作程序】
1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數(shù)目。
2． 將倍比稀釋的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標本按100ul每孔加入。
3． 酶標板加上蓋，37℃反應90分鐘。
4． 反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體；或甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5． 將準備好的*抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
7． 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
9． 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液，37℃避光反應，反應過程中，要經(jīng)常的觀察，當肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應zui長不要超過30分鐘）。
10． 用酶標儀在450nm測定O.D.值。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。
