人14-3-3蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒【試劑的準(zhǔn)備和保存】
A. 人14-3-3蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和使用：在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。將凍干品管內(nèi)加入500ul樣品稀釋液，*溶解后取出250ul加入到750ul樣品稀釋液中，混勻后做倍比稀釋。
稀釋后的人14-3-3蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在2小時(shí)內(nèi)使用。

B．*標(biāo)記人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體工作液：在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計(jì)算總的用量（實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul*標(biāo)記人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體加人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

C．親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）工作液的準(zhǔn)備：在使用前1小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計(jì)算總的用量（實(shí)配時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

D. TMB工作液的準(zhǔn)備：在使用前1小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。取TMB顯色液A 9份加TMB顯色液B 1份，混勻后即為T(mén)MB工作液，切忌TMB工作液要避光保存，使用的過(guò)程中，避免接觸金屬器械。

人14-3-3蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒【操作程序】
1． 確定本次檢測(cè)所需的已包被人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。
2． 將倍比稀釋的人14-3-3蛋白標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對(duì)照。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入。
3． 酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90分鐘。
4． 反應(yīng)后用自動(dòng)洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體；或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對(duì)著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5． 將準(zhǔn)備好的*人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
7． 將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
9． 每孔0.1ml依次加入TMB工作液，37℃避光反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中，要經(jīng)常的觀察，當(dāng)肉眼可見(jiàn)人14-3-3蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔差別不明顯時(shí)，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應(yīng)zui長(zhǎng)不要超過(guò)30分鐘）。
10． 用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定O.D.值。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍，其實(shí)際濃度應(yīng)該×N。

【注意事項(xiàng)】
1． 開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
2． 配制各種試劑時(shí)，切記混勻！
3． 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
4． 建議所有人14-3-3蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測(cè)。
5． 要嚴(yán)格避免操作過(guò)程中酶標(biāo)板干燥。干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活！
6． 為免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。