T7 Endonuclease I

T7 核酸內(nèi)切酶 I 識別并切割不配對 DNA、十字型結(jié)構(gòu) DNA、Holliday 結(jié)構(gòu)或交叉 DNA、異源雙鏈 DNA 或者以更慢的速度切割含切刻的雙鏈 DNA。該酶切割錯配堿基 5′ 端的、第二或第三個磷酸二酯。
本產(chǎn)品是通過克隆重組表達 T7 核酸內(nèi)切酶 I 基因，獲得的高純度蛋白，該酶無其他內(nèi)切酶或外切酶污染。
活性定義：在 50 μl 反應(yīng)體系，37℃ 條件下，1 小時將90% 以上的 1 μg 超螺旋十字型結(jié)構(gòu)的 pUC（AT）* 轉(zhuǎn)化成 90% 以上的線性結(jié)構(gòu)所需要的酶量定義為一個活性單位。
應(yīng)用：
基因突變、SNP、TALEN 或 CRISPR/Cas9 形成的突變體檢測識別錯配 DNA分解四方向交叉 DNA 或分支 DNA檢測或切割異源二聚體 DNA 和切刻 DNA隨機切割線性 DNA 進行 shot-gun 克隆1X T7 Endonuclease I Buffer：
50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2 ，1 mMDTT（pH 7.9 @ 25℃）
酶儲存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.5。
儲存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反復(fù)凍融。
注意事項
(1) T7 核酸內(nèi)切酶 I 是一種具有底物結(jié)構(gòu)選擇性的酶；該酶以不同的活性作用于不同的 DNA 底物。切割特定底物，必須控制酶量和反應(yīng)時間。
(2)反應(yīng)溫度超過 42℃時，會增加非特異性核酸酶活性。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。