樣本標(biāo)記分析

注意：該標(biāo)記方案是針對(duì)山羊抗小鼠IgG與ICG的綴合物開(kāi)發(fā)的。

1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（溶液A）：

將100L反應(yīng)緩沖液（例如，1M碳酸鈉溶液或1M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900L目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液（例如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2mg / ml，）混合，得到1 mL蛋白標(biāo)記儲(chǔ)備液。

注意1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。 如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則需使用1M碳s氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。

注意2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。

注意3：牛血清白蛋白（BSA）、明膠穩(wěn)定不純的抗體等標(biāo)記的效果不理想。 疊d化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。 可以通過(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊d化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。

注意4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率明顯降低。 為獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）：

將無(wú)水DMSO加入到ICG染料小瓶中以制備10-20mM儲(chǔ)備溶液。 通過(guò)移液或渦旋混合均勻。

注意：在開(kāi)始綴合之前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B），現(xiàn)配現(xiàn)用，保持溶液新鮮。 染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。 溶液B可以在不受光照和潮濕的情況下儲(chǔ)存在冰箱中兩周。 避免凍融循環(huán)。

3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。我們建議您通過(guò)使用連續(xù)不同量的標(biāo)記染料溶液重復(fù)步驟4和5來(lái)實(shí)驗(yàn)確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對(duì)于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。

3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起點(diǎn)：將5μl染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中，蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。

注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。

3.2運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)（見(jiàn)下面的步驟4）。

3.3重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。

3.4使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。

3.5計(jì)算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比例（DOS）。

3.6運(yùn)行上述4種綴合物的功能檢測(cè)，確定的染料/蛋白質(zhì)比例，以擴(kuò)大標(biāo)記反應(yīng)。

4.運(yùn)行綴合反應(yīng)：

4.1在有效搖動(dòng)下，將適量的染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）加入到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中。

注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。 如果跳過(guò)步驟3，我們建議使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）。

4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

5.純化綴合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實(shí)例。

5.1按照制造說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。

5.2將反應(yīng)混合物（直接來(lái)自步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

5.3樣品在頂部樹(shù)脂表面下方運(yùn)行時(shí)，加入PBS（pH 7.2-7.4）。

5.4將更多PBS（pH 7.2-7.4）加入所需樣品中以完成柱純化。

注意1：對(duì)于立即使用時(shí)，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋?zhuān)⒌确侄啻问褂谩?/span>

注意2：對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。